金雀凉血解毒颗粒对大鼠湿疹模型免疫调节作用机制研究

发布时间：2020-07-18 19:42

【摘要】：研究目的:本实验主要通过建立大鼠湿疹模型,来研究金雀凉血解毒颗粒对湿疹大鼠炎症以及免疫相关指标的影响,逐步探讨金雀凉血解毒颗粒的相关作用机制。为本方今后在临床上的推广和使用提供有力的理论及实验依据,为明确本方具体的作用路径及靶点提供理论支撑。研究方法:随机将60只大鼠分成6组,每组各10只,依次为空白组、模型组、复方甘草酸苷组、金雀凉血解毒颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组。除去空白组10只大鼠外,其余各组大鼠利用7%二硝基氯苯(DCNB)溶液涂擦大鼠背部建立湿疹模型。湿疹模型完成后称重,按体重开始给药10天(给药计算方法:按照体表面积换算法,将人每天给药剂量换算成大鼠即为4g/kg,人的临床给药剂量为中剂量组,高剂量给药浓度增加一倍,低剂量给药剂量减少一倍),最后一次给药后12h禁食不禁水,称重后处死取材,腹主动脉取血,摘取脾脏、胸腺、剪取造模处皮肤。脾脏、胸腺直接称重计算脏器指数,皮肤组织每组取三个用甲醛固定做病理切片,其余取完直接液氮冷冻后放入-80℃冰箱备用。腹主动脉取血,肝素钠抗凝,静置大约1小时后离心(2000转15分钟),取上层血清储存于-80℃冰箱,以备后续实验。采用HE染色观察大鼠局部湿疹皮损组织病理学变化;采用酶联免疫吸附法检测血清中炎症细胞因子IL-2、IL-4、IL-1β、IFN-γ、TNF-α含量,体液免疫中IgA、IgG、IgM免疫球蛋白含量,补体免疫因子C3、C4的影响;采用Western blot法检测湿疹皮损组织中P-P38和NF-κB65的蛋白表达水平;采用Real time PCR法检测湿疹皮疹组织中TNF-α和IL-1βmRNA表达水平。并对各项指标的数据进行统计,应用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析。研究结果:1、大鼠湿疹实验动物模型复制成功。利用DNCB诱导的大鼠湿疹模型,使大鼠背部皮损出现红斑、丘疹、渗液、结痂等湿疹样改变,造模后大鼠出现不停搔抓、翻滚等行为,符合实验动物学湿疹造模成功表现。与空白组比较,模型组皮损评分具有临床统计学意义(P0.05)。皮损评分平均值2.62(总分3分),大鼠湿疹模型建立成功。2、HE染色结果提示:空白组大鼠,表皮层、真皮层结构完好,层次分明,厚度正常。模型组大鼠,皮肤角化过度、角化不全、颗粒层肥厚、棘层肥厚、真皮水肿,内可见少量巨噬细胞及嗜中性粒细胞浸润。皮肤病理所见符合湿疹皮损表现,证明湿疹模型大鼠建立成功。给药10天后处死取材,病理组织发现,高、中、低剂量金雀凉血给药组和复方甘草酸苷组都能抑制皮损角化过度、角化不全、颗粒层肥厚、棘层肥厚的病理改变。与模型组比较,具有显著性差异。3、ELISA结果显示:与空白组相比,湿疹大鼠模型组血清中IL-2与IFN-γ的表达降低(P0.05),而IL-4、TNF-α IL-1β的表达升高(P0.05);经各剂量金雀凉血解毒颗粒及复方甘草酸苷治疗后,IL-2与IFN-y的含量均有所升高,IL-4、TNF-α、IL-1β的含量均有所降低,与模型组比较有统计学差异(P0.05),且中剂量金雀凉血解毒颗粒给药组效果优于复方甘草酸苷组。结果说明:中剂量金雀凉血解毒颗粒组(临床剂量)可有效升高IL-2与IFN-y的含量、降低IL-4、TNF-α、IL-1β的含量,作用优于复方甘草酸苷对照组。4、脾脏指数和胸腺指数结果显示:与空白组相比,湿疹模型大鼠脾脏指数、胸腺指数均降低(P0.05),提示湿疹大鼠免疫功能降低;经各剂量金雀凉血解毒颗粒及复方甘草酸苷对照组给药后,各组脾脏指数和胸腺指数均有不同程度增高。其中,复方甘草酸苷组及中剂量金雀凉血解毒颗粒组脾脏指数显著增高,复方甘草酸苷组及高、中剂量金雀凉血解毒颗粒组胸腺指数明显升高,与模型组相比,有统计学差异(P0.05)。结果说明:中剂量金雀凉血解毒颗粒组能显著提高湿疹模型降低的脾脏指数,高、中剂量金雀凉血解毒颗粒组能显著增高湿疹模型降低的胸腺指数,改善湿疹大鼠免疫器官功能,其作用优于复方甘草酸苷对照组。5、IgA、IgM、IgG检测结果显示:与空白组比较,实验鼠造模后血清中IgA、IgM、IgG含量均显著升高,有统计学差异(P0.05),提示湿疹大鼠体液免疫功能失衡;经中剂量金雀凉血解毒颗粒治疗后,血清中IgA、IgM、IgG含量均显著降低,与模型组比较有明显差异(P0.05),且中剂量作用优于复方甘草酸苷组。结果说明:中剂量金雀凉血解毒颗粒能降低湿疹模型大鼠体液免疫中免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量,其调节体液免疫的作用优于复方甘草酸苷组。6、C3、C4检测结果显示:与空白组比较,实验鼠造模后血清中C3、C4含量均明显增多,有统计学差异(P0.05),提示湿疹大鼠免疫功能失衡;经中剂量金雀凉血解毒颗粒治疗后,血清中C3、C4含量均明显减少,与模型组比较有统计学差异(P0.05),且效果优于复方甘草酸苷对照组。结果说明:中剂量金雀凉血解毒颗粒可以有效降低大鼠湿疹模型血清中升高的补体免疫因子C3、C4的含量,调节免疫失衡,作用优于复方甘草酸苷组。7、Western Blot和Real-time PCR检测结果显示:与空白组比较,模型组大鼠皮损组织中P-P38和NF-KB65蛋白和TNF-α和IL-1β基因表达均明显升高(P0.01);经各剂量金雀凉血解毒颗粒及复方甘草酸苷治疗后,皮损组织中P-P38和NF-KB65的蛋白和TNF-α和IL-1β基因表达均显著降低,与模型组比较有统计学差异(P0.01),其中,复方甘草酸苷对照组效果优于各剂量金雀凉血解毒颗粒组。结果说明:各剂量金雀凉血解毒颗粒组以及复方甘草酸苷对照组都能有效降低P-P38和NF-KB65蛋白和TNF-α和IL-1 β3基因表达。结论:1、金雀凉血解毒颗粒可有效改善大鼠湿疹模型炎症情况,降低皮损评分,有效控制病情发展。2、金雀凉血解毒颗粒可有效升高大鼠湿疹模型IL-2与IFN-y的含量、降低IL-4、TNF-α、IL-1β的含量,从而起到抑制湿疹炎症表达的作用。3、金雀凉血解毒颗粒可有效调节大鼠免疫球蛋白IgA、IgM、IgG,补体免疫因子C3、C4,胸腺指数、脾脏指数等各项免疫指标的异常,证实本方的作用机制与调节大鼠免疫功能有关。4、金雀凉血解毒颗粒可以抑制P38MAPK/NF-KB通路上相关因子P-P38和NF-KB65的蛋白水平和TNF-α和IL-1β基因表达水平从而下调了相关炎症因子,提示了金雀凉血解毒颗粒可能通过抑制P38MAPK/NF-KB通路的活化,从而减轻大鼠湿疹模型的炎症反应并调节其免疫功能。
【学位授予单位】：黑龙江中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

湿疹,空白,实验思路,中医药大学

黑龙江中医药大学博士学位论文逡逑图１：逦、邋＿逦１逦？逡逑１１１．邋，邋Ｍ逡逑ＡＢＣ逡逑＾邋｜ｌ邋１邋＇Ｉ邋１逦１逡逑—Ｌ－“上」逡逑Ｄ逦Ｅ逦Ｆ逡逑图１：邋Ａ为阴性对照空白组；Ｂ－Ｆ为随机分为的５组湿疹模型组。逡逑逦表１皮损评分表逦逦逡逑组别逦？逦平均得分逦Ｔｊ｜逦Ｐ逦逡逑Ａ邋组逦１０逦０逦０＿０８逡逑Ｂ邋组逦１０逦２＿７３逦０．１３逦０．０２７＊逡逑Ｃ邋组逦１０逦２．５８逦０．１２逦０．０１５＊逡逑Ｄ邋组逦１０逦２．６１逦０．１９逦０．０３１＊逡逑Ｅ邋组逦１０逦２．６０逦０．０９逦０．０１７＊逡逑Ｆ邋组逦１＿０逦２＾５９逦０￡２逦０．０２６＊逡逑图１和表１为皮损评分数据采用ＳＰＳＳ邋２２．０统计软件进行处理，计量逡逑资料以ｘ±ｓ表不，进行ｔ检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。Ｂ、Ｃ、Ｄ、逡逑Ｅ、Ｆ组分别与Ａ组评分相比，均具有临床统计学意义，＊Ｐ＜０．０５。逡逑２．实验分析与讨论逡逑成功的湿疹大鼠动物模型的建立是后期进行实验研宄观察的基础，因逡逑此，在笔者在实验思路设计阶段查阅了大量湿疹相关研宄的文献

电泳,样本,清单,名称

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【参考文献】