冠心清化散抗动脉粥样硬化机理及对血管内皮细胞的保护作用的实验研究

发布时间：2020-07-19 11:56

【摘要】：目的:本研究以冠状动脉粥样硬化发生、发展的两个关键点——动脉壁脂质沉积及细胞的异常增殖为切入点,通过冠心清化散在防治兔动脉粥样硬化作用研究,探讨其抗动脉粥样硬化的作用机制,为“瘀能化水”理论提供可靠地实验证据。方法:1、动脉粥样硬化家兔模型建立与评价:16只普通级纯种雄性新西兰家兔,适应性饲养2周后,随机分为空白组(8只)及模型组(8只),继空白组给予普通饲料喂养;模型组给予高脂饲料喂养+免疫损伤以制备实验性动脉粥样硬化模型。连续喂养10周。检测血清总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)水平;观察主动脉弓整体油红O染色结果,以此判定造模成功与否。2、冠心清化散对动脉硬化家兔血脂及斑块的影响:60只普通级纯种雄性新西兰家兔,适应性饲养2周后,随机分为空白组、模型组、阳性药物组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,各10只。除空白组外,其余组给予高脂饲料喂养+免疫损伤制备实验性动脉粥样硬化模型。同时中药低、中、高剂量组分别以6.7g/kg/d、13.4g/kg/d、26.8g/kg/d,予冠心清化散悬液灌胃;阳性药物组予辛伐他汀悬液灌胃3mg/kg/d灌胃,连续灌胃观察12周。检测TC、TG、LDL-C、HDL-C水平;观察主动脉弓整体油红O染色结果。3、冠心清化散抗动脉粥样硬化机理研究采用双抗夹心ELISA酶联免疫吸附法检测血清超氧化物歧化酶活性(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)。采用Western blot法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox4)、氧化酶p22phox蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、ATP结合盒转运蛋白G1(ABCG1)、B族I型清道夫受体(SR-B1)、CD36表达。采用RT-PCR法检测Nox4、p22phox蛋白、PPARγ、ABCA1、ABCG1、SR-B1、caveolin-1 mRNA表达。4、冠心清化散对血管内皮细胞的保护作用采用Western blot方法检测碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)与细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated kinase1/2,ERK1/2)、成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptors 1,FGFR1)、p21ras蛋白的表达。结果:1、采用高脂饲养加免疫损伤法成功建立兔动脉粥样硬化模型。2、冠心清化散中、高剂量组可降低动脉粥样硬化兔的TC、TG、LDL-C水平,升高HDL-C的水平。其降脂效果同辛伐他汀(P0.05)。阳性药物组与高、中、低剂量组虽见到脂质条纹形成,但阳性药物组与中、高剂量组较模型组相比,内膜红色斑片状区明显减少,与模型组的红色粥样斑块形成鲜明对比。3、冠心清化散可有效升高SOD含量、降低MDA含量(P0.05),但中剂量组效佳;可有效减少Nox4和p22phox等胞膜NADPH氧化酶活性,降低动脉氧化应激水平。4、冠心清化抑制CD36的表达;提高ABCA1、ABGA1、SR-B1;减少PPARγ表达。5、冠心清化散可降低FGFR1、bFGF、p21ras、ERK1/2的蛋白表达。结论:1、冠心清化散可明显改善动脉粥样硬化兔的血脂水平;减少内膜脂质条纹、动脉粥硬化斑块的形成。2、冠心清化散抗动脉粥样硬化机制之一可能为抗氧化应激:调控Nox4和p22phox等胞膜NADPH氧化酶活性,降低动脉氧化应激水平可能是冠心清化散发挥抗氧化应激的重要机制。3、冠心清化散抗动脉粥样硬化机制之二可能为调节巨噬细胞内胆固醇平衡:抑制CD36的表达,减少巨噬细胞胆固醇的摄入;提高ABCA1、ABGA1、SR-B1、caveolin-1表达,加强胆固醇的逆转运,其机制考虑与激活或增加PPARγ表达有关。4、冠心清化散可抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,从而减少细胞增殖与分化,起到保护细胞的作用。
【学位授予单位】：长春中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

条纹,血脂水平,情况,内膜

模型组 21.52±2.52* 4.54±1.36* 12.43±2.69* 4.28±0.64*注：VS正常组*P<0.05。图1-1 两组血脂水平情况2 主动脉弓整体油红O染色正常组主动脉大体观察呈乳白色，弹性较好，内膜较光滑平整，油红着色极少。模型组，其主动脉油红O染色结果与正常组比较其主动脉弹性差，内膜多处可见斑片状红色区域，即脂质条纹形成。见图1-2。

主动脉弓,小鼠

空白组对照组图1-2 主动脉弓整体油红O染色讨论对于动脉粥硬化病因病机的探讨、治疗方法的探索、防治药物的研发，等等研究的重要工具及前提是，建立稳定、可靠、可重复性高的动脉粥硬化动物模型。1 模型动物的选择1.1 鼠该模型的病变特点为，病变的形态及斑块的破裂位置与人类相似。但有别于人类，斑块破裂处缺乏纤维蛋白和血栓形成[4]。鼠科中常被用于建立动脉粥样硬化模型的有小鼠和大鼠。1.1.1 小鼠小鼠，在生物分类学上属脊椎动物门、哺乳动物纲、啮齿目、鼠科、鼷鼠属、小家鼠种。根据遗传可以分为近交系、封闭群和突变系。小鼠具有繁殖快、易于控制、体积小等特点；同时对小鼠质量控制已有明确标准；现已拥有大量近交系、封闭群和突变系；加之遗产工程小鼠的培育迅速增加，因此在哺乳类各种实验动物研究中，用量最多，用途亦最广。在动脉粥样硬化模型中，小鼠因其取血不便、动态观察较难，故很少采用。但随着转基因技术和基因敲除技术的出现，已成功研制出不少新的AS模型小鼠

条纹,血脂水平,情况

50图2-1 血脂水平情况2 主动脉弓整体油红O染色正常组主动脉大体观察呈乳白色，弹性较好，内膜较光滑平整，未见油红着色。模型组，其主动脉油红O染色结果与正常组比较其主动脉弹性差，血管内膜表面不平，可见弥漫性、融合成片的红色粥样斑块隆起凸出于表面。阳性药物组与高、中、低剂量组虽见到脂质条纹形成，但阳性药物组与中、高剂量组较模型组相比，内膜红色斑片状区明显减少。见附图1。讨论1 药物选择1.1 冠心清化散立方依据及组方来源动脉粥样硬化是导致冠心病的重要因素，贯穿于心绞痛、心肌梗死、支架术后、搭桥术后、冠心病心衰等系列心血管事件链的始终。目前冠心病的治疗侧重于稳定斑块，认为动脉内粥样斑块越稳定越好。黄永生教授在多年的临床实践中，对斑块的逆转和消退进行了大量的探索

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