加减驻景方干预大鼠脉络膜新生血管形成的机制研究
发布时间：2020-07-19 23:29
【摘要】：目的1.观察氪激光建立实验性脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)模型的可行性和成功率,为CNV的相关实验研究奠定基础。2.观察 AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与 TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路在CNV形成中的作用。3.观察中药加减驻景方和Conbercept对实验性CNV的干预作用,以及对AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路和TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路活性的影响,比较不同治疗对CNV的干预效果,推测可能存在的干预机制,为CNV的治疗提供理论及实验性依据。方法1.通过659 nm氪激光诱导棕色挪威(brown Norway,BN)大鼠建立实验性CNV动物模型。分别于光凝后7 d、14 d、21 d,通过眼底荧光血管造影(fundus fluorescein angiograph,FFA)与引哚青绿血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)检查观察CNV变化。FFA与ICGA检查后处死大鼠,制作眼组织病理学标本,通过HE染色和CD105免疫组织化学染色法观察CNV变化。2.通过659 nm氪激光诱导BN大鼠建立CNV动物模型。分别于光凝后7 d、14 d、21 d处死取材制作病理学标本,采用免疫组织化学法观察CNV组织中AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路相关蛋白的表达量。于光凝后21 d,处死取材,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测 眼组织中AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路相关因子mRNA的表达情况。3.通过659 nm氪激光诱导BN大鼠建立CNV动物模型。造模后的大鼠被随机分为模型组、中药组、西药组和联合治疗组。模型组大鼠用生理盐水灌胃,中药组用加减驻景方灌胃治疗,西药组用玻璃体腔注射Conbercept治疗,联合治疗组用玻璃体腔注射Conbercept和加减驻景方灌胃治疗。分别于光凝后7 d、14d、21d,进行FFA与ICGA检查。FFA与ICGA检查后每组处死6只大鼠制作病理学标本,通过HE染色观察CNV变化,通过免疫组织化学法观察各组大鼠 CNV 组织中 AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路与 TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路相关蛋白的表达量。于光凝后21 d,每组处死12只大鼠获取眼组织标本,使用RT-qPCR和蛋白免疫印迹(Western blotting)检测观察各组大鼠AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路与 TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路 mRNA 和蛋白的相对表达量。结果1.模型组BN大鼠光凝后7 d的FFA图像出现明显荧光素渗漏,14 d时渗漏强度逐渐增强(P0.05),21 d时无明显变化(P0.05),有荧光素渗漏的光斑在ICGA均呈充盈状态。光凝后7 d、14 d、21 d CNV发生率分别为77.08%、85.42%、89.58%,差异无统计学意义(P0.05)。组织病理学结果显示随光凝时间推移,CNV中央厚度逐渐增加(P0.05)。光凝后7 d,CNV中可见CD105因子标记的新生血管,阳性反应物呈棕黄色;14 d阳性反应物逐渐增多(P0.05);21d无明显变化(P0.05)。正常BN大鼠视网膜组织结构中CD105表达呈阴性,未见棕黄色反应物。2.AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB 和 IL-6 蛋白在模型组BN大鼠视网膜组织中均呈强阳性表达,CNV组织中可见大量黄棕色阳性反应物。HIF-1α、TLR-4和IL-6蛋白在光凝后7 d时有明显表达,在14 d时达到高峰,21 d时逐渐减少(P0.05)。AKT、mTOR蛋白表达量在7d时最多,21 d时缓慢减少(P0.05)。VEGF在光凝后7d时表达量达到最大值,随后逐渐减少(P0.05)。NF-κB在光凝后7 d时有明显表达,在14 d时达到高峰,21 d时变化不明显(P0.05)。RT-qPCR结果显示,模型组AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB与IL-6 mRNA相对表达量较对照组均有显著增强(P0.05)。3.光凝后7 d、14 d、21 d,模型组与各治疗组CNV形成率达70%以上,差异无统计学意义(P0.05)。各治疗组FFA荧光素渗漏在光凝后7 d时最强,随后变化不明显,有荧光渗漏的光凝斑在ICGA呈充盈状态。光凝后7 d,中药组与模型组荧光素渗漏强度较高,西药组次之,联合组渗漏程度最轻(P0.05)。14 d与21 d时,各治疗组荧光素渗漏强度均弱于模型组,联合组治疗效果最优,西药组治疗效果优于中药组(P0.05)。光凝后7 d,西药组和联合组CNV中央厚度都显著低于模型组和中药组(P0.05)。光凝后14 d与21 d时,各治疗组CNV中央厚度均低于模型组,联合组降低CNV中央厚度的效果最优,西药组次之,西药组优于中药组(P0.05)。免疫组织化学结果显示,各治疗组视网膜光凝区 CNV组织中AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF、TLR-4、NF-κB 与 IL-6 蛋白的表达都呈阳性,CNV 组织中可见大量黄棕色阳性反应物。随着治疗时间延长,各治疗组目的蛋白表达量均低于模型组(P0.05)。光凝后7 d到21 d,AKT、mTOR、HIF-1α和VEGF的表达量在中药组、西药组和联合组中呈现依次递减趋势(P0.05),TLR-4和NF-κB表达量在西药组最高,联合组最低(P0.05)。在光凝后7 d与14d时,联合组IL-6表达量低于西药组(P0.05)。光凝后21 d,中药组和联合组均低于西药组(P0.05)。RT-qPCR结果显示,模型组与各治疗组目的基因mRNA相对表达量较对照组均有明显增多(P0.05)。除mTOR以外,各治疗组目的基因mRNA相对表达量均低于模型组(P0.05),中药组mTOR mRNA相对表达量与模型组无明显差异(P0.05)。各治疗组AKT、mTOR、VEGF和NF-κB mRNA相对表达量由高到低依次为中药组、西药组和联合组,差异有统计学意义(P0.05)。中药组HIF-1αmRNA相对表达量高于西药组和联合组(P0.05),西药组和联合组之间无明显差异(P0.05)。TLR-4 mRNA相对表达量联合组最低(P0.05),西药组与中药组无明显差异(P0.05)。IL-6 mRNA相对表达量中药组最低(P0.05),西药组与联合组无明显差异(P0.05)。Western blotting结果显示,实验组各目的蛋白相对表达量较对照组均有明显增多(P0.05),除AKT蛋白以外,各治疗组目的蛋白相对表达量均低于模型组(P0.05)。AKT和HIF-1α蛋白相对表达量在中药组中高于西药组和联合组(P0.05)。mTOR与VEGF蛋白相对表达量由高到低依次为中药组、西药组和联合组(P0.05)。TLR-4蛋白相对表达量在西药组中高于中药组和联合组(P0.05)。NF-κB蛋白相对表达量在中药组中高于西药组和联合组(P0.05)。IL-6蛋白相对表达量在中药组中低于西药组与联合组(P0.05)。结论1.659 nm氪激光诱导BN大鼠建立CNV模型成功率高,且具有与人类CNV相似的病理过程和细胞组成。2.FFA联合ICGA检查可以动态观察CNV变化,荧光渗漏强度AOD值可用于半定量评估CNV形成情况。3.AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路与 TLR-4/NF-κB/IL-6 信号通路在 CNV动物模型中被激活。AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路的活化促进了实验性CNV的形成。4.联合组干预CNV的效果明显优于中药组和西药组,中西药联合治疗对AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路的活性具有明显的抑制作用。5.加减驻景方具有抑制实验性CNV的作用。加减驻景方可以降低AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路与TLR-4/NF-κB/IL-6信号通路的活性,加减驻景方可能是通过上述信号通路发挥多靶点抑制CNV的作用。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：
３．１．１眼底表现逡逑正常ＢＮ大鼠眼底彩照可见视网膜颜色淡红，圆形视盘居中，视网膜血管逡逑围绕视盘呈放射状分布。见图１。逡逑模型组ＢＮ大鼠视网膜彩照可见在血管间隙分布的光凝斑，大部分光凝斑逡逑有气泡形成，光凝中心呈浓集的白点，周围呈环形灰白色水肿，光凝斑边界不逡逑清，少数光斑下可透见少量出血。随着光凝后时间推移，视网膜水肿逐渐减轻，逡逑视网膜下出血逐渐吸收，光凝斑边界逐渐清晰，部分相邻的光凝斑可出现融合。逡逑见图２。逡逑３．１．２邋ＦＦＡ、ＩＣＧＡ表现及荧光素n蚵粒希闹到峁义险＃拢未笫螅疲疲镣枷窨杉优叹又校油ぱ鼙挥馑爻溆茏咤义闲巫匀纾鼙诠饣暾抻馑厣保茫牵潦韭雎缒ぱ艹释础＜义贤迹常浚础ｅ义夏Ｐ妥椋拢未笫螅疲疲镣枷窨杉笾戮确植荚谘芗湎兜挠馑厣珏义掀谟馑厣┏实阕
本文编号：2763116
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：
３．１．１眼底表现逡逑正常ＢＮ大鼠眼底彩照可见视网膜颜色淡红，圆形视盘居中，视网膜血管逡逑围绕视盘呈放射状分布。见图１。逡逑模型组ＢＮ大鼠视网膜彩照可见在血管间隙分布的光凝斑，大部分光凝斑逡逑有气泡形成，光凝中心呈浓集的白点，周围呈环形灰白色水肿，光凝斑边界不逡逑清，少数光斑下可透见少量出血。随着光凝后时间推移，视网膜水肿逐渐减轻，逡逑视网膜下出血逐渐吸收，光凝斑边界逐渐清晰，部分相邻的光凝斑可出现融合。逡逑见图２。逡逑３．１．２邋ＦＦＡ、ＩＣＧＡ表现及荧光素n蚵粒希闹到峁义险＃拢未笫螅疲疲镣枷窨杉优叹又校油ぱ鼙挥馑爻溆茏咤义闲巫匀纾鼙诠饣暾抻馑厣保茫牵潦韭雎缒ぱ艹释础＜义贤迹常浚础ｅ义夏Ｐ妥椋拢未笫螅疲疲镣枷窨杉笾戮确植荚谘芗湎兜挠馑厣珏义掀谟馑厣┏实阕
本文编号：2763116
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zhongyaolw/2763116.html
最近更新
教材专著
