姜黄素及姜黄提取物通过抗凝、抗炎途径对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭作用对比研究

发布时间：2020-07-20 13:15

【摘要】：目的:通过比较姜黄素、姜黄提取物的抗肝癌细胞活性,对比抗凝作用占优势的姜黄提取物与抗炎作用占优势的姜黄素两者的抗肝癌Hep G2细胞增殖、侵袭作用差异,验证活血化瘀中药的抗炎-抗肝癌途径作用机制。方法:(1)采用CCK8法,观察梯度浓度姜黄提取物(CLE:171.5、343、686、1372μg/m L)、姜黄素(Cur:14.7、29.5、58.9、117.8μg/m L)作用于Hep G2细胞后细胞增殖能力,并由此计算此药物的半数有效浓度(IC_(50)),将以抗凝作用为主的姜黄提取物中姜黄素含量8.59%换算,将姜黄提取物中的姜黄素1/2IC_(50)与姜黄素1/2IC_(50)对比其抑制率,并取1/2IC_(50)浓度作为后续实验的工作液浓度。(2)将1/2IC_(50)质量浓度的姜黄提取物,与姜黄提取物中姜黄素含量换算后的等剂量姜黄素,在梯度浓度的LPS(0、3、6、12、24、48μg/m L)刺激诱导下采用CCK8法对比检测对Hep G2细胞的增殖抑制率。初步判断姜黄以抗炎-抗肝癌作用途径还是以抗凝-抗肝癌作用途径为主导作用?(3)凝血酶(Th)5U/m L刺激人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)产生HUVECs释放液,ELISA法检测分成空白对照组、凝血酶组、凝血酶加LPS组HUVECs释放液中组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、IL-6的水平。(4)CCK8法检测LPS诱导与HUVECs释放液对Hep G2细胞的增殖能力影响的对比(5)CCK8法对比检测姜黄提取物、姜黄素对HUVECs释放液诱导下Hep G2细胞的增殖的影响(6)姜黄素与姜黄提取物对人肝癌Hep G2细胞的侵袭能力的对比研究(7)RT-PCR检测IL-6、i NOS的基因表达变化。Western blotting方法检测IL-6、i NOS的蛋白的表达变化。结果:(1)LPS对Hep G2细胞的增殖起促进作用呈一定的时间-剂量依赖性;LPS大于50μg/ml时,随着浓度的增加和时间的延长,LPS对Hep G2细胞的增殖起抑制作用,因此LPS以50μg/ml作为诱导干预浓度。(2)姜黄提取物和姜黄素均可以抑制人肝癌Hep G2细胞的增殖(P0.05),并且呈一定的时间-剂量依赖性。经计算姜黄素IC_(50)(24 h)值为48.43μg/m L,在后续实验中,确定姜黄素处理Hep G2细胞的工作质量浓度分别为24μg/m L和48μg/m L。姜黄提取物IC_(50)(24 h)值为663.1μg/m L,确定姜黄提取物处理Hep G2细胞的工作质量浓度分别为331.5μg/m L和663μg/m L。经计算姜黄提取物中的姜黄素的IC_(50)(24 h)值为56.93μg/m L,与姜黄素IC_(50)(24 h)值48.43μg/m L相当接近。说明姜黄提取物主要依靠姜黄素发挥抑制肝癌Hep G2细胞增殖作用。确定姜黄提取物中经含量换算后所含姜黄素对应的等量姜黄素,处理Hep G2细胞的工作质量浓度57μg/m L和28.5μg/m L。后续细胞迁移、侵袭能力及蛋白表达的影响实验检测均以姜黄提取物331.5μg/m L以及其中姜黄素含量换算对应等量姜黄素28.5μg/m L为对比工作浓度。(3)在LPS炎性诱导下,姜黄提取物以姜黄素对抗炎症反应过程从而增加hep G2细胞增殖抑制率,而其中的抗凝成分对Hep G2增殖抑制率无明显影响。(4)姜黄提取物中抗凝成分能有效拮抗凝血酶刺激释放液中t-PA、PAI-1的释放,姜黄提取物、姜黄素均具有抗凝、抗炎双重作用,姜黄提取物以抗凝作用占优势,而姜黄素以抗炎作用占优势。(5)在HUVECs释放液中t-PA、PAI-1、IL-6等因子作用下,人肝癌Hep G2细胞的增殖能力无显著变化。姜黄素对肝癌Hep G2细胞的抑制作用略大于姜黄提取物。进一步说明姜黄的对Hep G2细胞的作用——姜黄提取物以抗凝作用占优势,而姜黄素以抗炎作用占优势。(6)无LPS干预组/LPS干预组的比值,与对照组比较,1/2IC_(50)及1/4IC_(50)姜黄提取物组经过LPS干预后均能使肝癌细胞穿过Matrigel基质胶的数目增加程度更高,侵袭能力明显增强(P0.05)。331.5μg/m L姜黄提取物LPS干预组对肝癌细胞侵袭能力作用无明显差异,(P0.05)。(7)1/2IC_(50)姜黄提取物处理Hep G2细胞24 h时,i NOS的m RNA表达均显著下调,差异显著(P0.05、0.01),且在炎性状态下姜黄提取物组降低作用明显优于姜黄素组,两组间比较差异显著(P0.01)。当LPS处理24h后,LPS对Hep G2细胞的促炎作用显著(P0.01)。对于LPS干预的炎性状态下Hep G2细胞,姜黄提取物LPS干预组及姜黄素LPS干预组对其IL-6的表达有明显抑制作用(P0.01),两组抑制作用相当,无明显差异(P0.05)。(8)Western blotting方法检测i NOS蛋白的表达结果显示,姜黄素及姜黄提取物对于LPS干预的炎性状态下Hep G2细胞的i NOS蛋白水平均有抑制作用。其中姜黄提取物LPS干预组降低作用明显强于姜黄素LPS干预组,两组间比较差异显著(P0.01)。检测IL-6蛋白的表达结果显示,对于LPS干预的炎性状态下Hep G2细胞,姜黄提取物LPS干预组及姜黄素LPS干预组对其IL-6蛋白表达有明显抑制作用(P0.05),两组抑制作用无明显差异(P0.05)。结论:1.姜黄素具有优良的抗炎作用,主要通过抗炎途径发挥抗肝癌效应。2.姜黄提取物具有优良的抗凝作用,虽然能明显拮抗t-PA、PAI-1等凝血因子,但对抗肝癌肿瘤细胞增殖、侵袭作用不明显。3.姜黄素及姜黄提取物主要通过下调IL-6、i NOS的基因表达及蛋白水平发挥抗炎作用。且姜黄提取物下调i NOS的基因表达及蛋白水平程度更低,但其对抗肝癌肿瘤细胞增殖、侵袭作用不明显。4.活血化瘀中药姜黄发挥抗肝癌作用效应主要通过抗炎途径,并非通过抗凝途径。
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

对照组

23表 1 姜黄素及姜黄提取物对 HepG2 细胞 iNOS 蛋白表达的影响 ( x±s, n = 3)注：与对照组比较：*P＜ 0.05**P＜ 0.01；与 Cur 组比较：▲ ▲P＜ 0.01；与 Control+LPS 组比较：△P＜ 0.05△ △P＜ 0.01；与 Cur+LPS 组比较：##P＜ 0.01。分组 Control Control+LPS Cur Cur+LPS CLE CLE+LPSiNOS 0.833±0.100 1.072±0.066* 0.617±0.076* 0.846±0.112△0.400±0.050▲▲** 0.541±0.053△

对照组

为ELISA脸测IL6水平，与对照组比较:*"P<0.01:与Th组比较:00P<0.01;图6为ELISA}浏t-PA水平，与对照组比较:*P<0.01;与Th组比较

对照组

【相似文献】