艳山姜挥发油对高糖诱导人脐静脉内皮细胞线粒体功能障碍的保护作用

发布时间：2020-07-20 15:03

【摘要】：内皮功能障碍是糖尿病血管疾病重要的病理基础,而线粒体在维持内皮细胞功能稳定中扮演了不可或缺的角色。高糖(HG)可引起血管炎症、氧化应激及线粒体功能障碍等,最终导致血管内皮损伤。NF-κB通路在血管内皮损伤发生和发展中起着极其重要的作用,沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)具有改善血管内皮功能障碍及延缓血管内皮细胞衰老的作用。姜科山姜属植物艳山姜(FAZ)是贵州省当地的民间习用药材,有研究表明其主要活性成分艳山姜挥发油(EOFAZ)对内皮细胞损伤有保护作用,但其作用的具体机制尚不明确。目的:1.研究NF-κB在HG诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤过程中的作用,探讨EOFAZ的保护作用。2.观察EOFAZ调节HG诱导HUVECs线粒体损伤,寻找防治HUVECs损伤的有效作用靶点。3.观察EOFAZ是否通过调控SIRT1/NF-κB通路而改善HUVECs线粒体损伤,进一步寻找防治内皮细胞线粒体损伤的关键作用靶点及保护措施。方法:1.体外传代培养HUVECs,取3-5代细胞用于实验。苏木素-伊红(HE)染色及吉姆萨(Giemsa)染色后用倒置显微镜观察细胞形态学改变。四氮唑盐比色法(MTT法)探索HG损伤HUVECs的最佳作用浓度及作用时间。建立HG诱导HUVECs损伤模型及EOFAZ预保护浓度梯度,并用检测乳酸脱氢酶(LDH)外漏量实验及MTT法验证。实验分对照组、HG组、HG+EOFAZ低剂量(EOFAZ浓度0.25μg/L)组、HG+EOFAZ中剂量(EOFAZ浓度1μg/L)组、HG+EOFAZ高剂量(EOFAZ浓度4μg/L)组、HG+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵盐(PDTC)组、甘露醇(Mannitol)组。各组细胞以划痕实验检测细胞迁移能力。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测白细胞介素-8(IL-8),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达,Western-blotting法检测血管细胞黏附分子-1(VCAM-1),血管细胞间黏附分子-1(ICAM-1),NF-κB p65,p-p65,IκBα蛋白表达水平。并用免疫荧光法进行NF-κB p65核转位检测。提取HUVECs核蛋白后检测NF-κB p65 DNA结合活性。2.HUVECs分为对照组、HG组、HG+EOFAZ低剂量(EOFAZ浓度0.25μg/L)组、HG+EOFAZ中剂量(EOFAZ浓度1μg/L)组、HG+EOFAZ高剂量(EOFAZ浓度4μg/L)组、HG+环孢素A(Cyclosporin)组。各组细胞用ELISA法测定测定丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α),caspase-3、caspase-9的表达;采用荧光探针JC-1法检测线粒体膜电位水平的变化,Western-blotting法检测线粒体动力相关蛋白1(Drp1)、线粒体融合基因2(Mfn2)蛋白表达水平,并分别提取HUVECs胞浆蛋白及线粒体蛋白后检测Bax蛋白的表达水平。流式细胞仪测定各组细胞凋亡及线粒体通透性转换孔(MTPT)的开放情况;用荧光素-荧光素酶法检测各组细胞的ATP含量。3.予优化siRNA SIRT1转染HUVECs的条件后,实验分为对照组、HG组、siRNA SIRT1组、siRNA SIRT1阴性对照组、siRNA SIRT1+HG组、EOFAZ+HG(EOFAZ浓度4μg/L)组、EOFAZ+siRNA SIRT1(EOFAZ浓度4μg/L)组。Real-time PCR法测定siRNA对HUVECs SIRT1 mRNA表达的影响,以及用Western-blotting法测定SIRT1、caspase-3、Mfn2、Drp1、p65、p-p65、IκBα、乙酰化NF-κB p65蛋白表达;用检测LDH外漏量测定反映细胞损伤情况;HUVECs线粒体可用MitoTracker Green荧光染料染为绿色,随之使用荧光显微镜观察各组细胞线粒体形态的变化;各组细胞用ELISA法测定TNF-α、IL-8、PGC-1α的表达;用荧光素-荧光素酶法检测各组细胞的ATP含量。结果:1.传代培养HUVECs,倒置显微镜观察细胞融合形成单层后呈铺路石状排列。MTT法检测确定EOFAZ(浓度为0.25-4μg/L)干预24 h后细胞活性没有明显改变(P0.05)。而HG最佳浓度为35mmol/L,最佳作用时间为24 h,此条件下HG诱导HUVECs存活率为68.7%±3.4%(P0.01),予浓度为0.25-4μg/L的EOFAZ预保护1 h后证实EOFAZ对HG诱导的HUVEC损伤呈现一定的剂量依赖保护作用。正式实验选择三个剂量的EOFAZ(0.25,1和4μg/L)来提供预保护。HG可显著诱导HUVECs的LDH外漏增加(P0.01),与EOFAZ预孵育1 h可以明显降低LDH外漏水平(P0.01);为了消除高渗性对HG诱导的LDH外漏的增加的影响,35mmol/L Mannitol孵育HUVECs对LDH外漏未见明显影响(P0.05)。HUVECs经HE染色后,可见对照组细胞核染成蓝紫色,细胞饱满,细胞质染成粉红色。细胞呈铺路石形状,细胞之间排列紧密,形态比较均一;HG组细胞数目减少,细胞核居中,细胞间隙增大,周围模糊,形态异于正常;EOFAZ组作用后细胞形态明显较HG组规则,细胞间隙变小;HUVECs进行Giemsa染色后,可见对照组细胞核呈现为紫红色,细胞浆呈现淡红色。对照组的细胞核偏于一侧、体积正常;HG组的细胞膨大,细胞核居中;相较于HG组,EOFAZ组及Mannitol组细胞融合呈铺路石状,形态规整均一,细胞之间排列较紧密。划痕实验表明相较对照组,HG作用后细胞迁移能力显著下降(P0.01),而预先给予EOFAZ孵育1 h后,细胞迁移能力明显增加(P0.01);EOFAZ干预可使HG诱导HUVECs炎症因子TNF-α和IL-8的分泌显著下调(P0.01)。加用NF-κB抑制剂PDTC干预后,可抑制HG诱导HUVECs ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达(P0.01)。EOFAZ预处理HG诱导的HUVECs后,ICAM-1和VCAM-1蛋白水平显著降低(P0.01)。HG处理后可以显著降低p65和IκBα及增加p-p65蛋白水平(P0.01),EOFAZ预处理后均可显著抑制上述变化(P0.01)。免疫荧光法进行核转位检测结果显示HG可诱导HUVECs NF-κB p65由胞质移位进入细胞核,EOFAZ可以抑制HG诱导的NF-κB p65核移位;HG刺激可显著增加NF-κB p65的DNA结合活性(P0.01),EOFAZ预处理1 h后NF-κB p65 DNA结合活性显著降低(P0.01)。表明HG介导的NF-κB激活可被EOFAZ抑制,EOFAZ可能是通过抑制NF-κB激活起作用的。2.HG刺激HUVECs后MDA显著增加(P0.01),而EOFAZ预保护可下调MDA的合成(P0.01)。MPTP抑制剂Cyclosporin也可显著降低MDA的合成(P0.01)。采用和HG组同浓度的甘露醇干预排除渗透压影响,和对照组比较未见明显改变;HG处理HUVECs后SOD及GSH-Px显著下降(P0.01),而EOFAZ组与HG组比较可上调GSH-Px合成,差异有统计学意义(P0.05),且显著提高SOD的合成(P0.01)。采用和HG组同浓度的甘露醇干预排除渗透压影响,和对照组比较未见明显改变;同时Cyclosporin组较HG组也可显著增加SOD及GSH-Px的含量(P0.01)。EOFAZ及Cyclosporin干预可使HG处理后的HUVECs JC-1绿色荧光翻转至红色,说明EOFAZ及Cyclosporin可增加HG诱导的线粒体膜电位水平下降;Western-blotting结果显示与HG组比较,EOFAZ组及Cyclosporin组Drp1蛋白表达显著减低(P0.01);且EOFAZ干预可上调Mfn2蛋白表达,差异有统计学意义(P0.05);HG组钙黄绿素平均荧光强度明显降低(P0.01),提示HG导致了HUVECs MPTP的持续开放,EOFAZ或Cyclosporin预处理可明显提高HG处理后细胞内钙黄绿素的平均荧光强度(P0.01),提示EOFAZ有助于HG处理后细胞MPTP稳定;HG干预后可显著导致caspase-3及caspase-9活性增强(P0.01),而EOFAZ可不同程度抑制此作用。流式细胞仪检测HUVECs凋亡程度,可见予HG作用后细胞凋亡率显著增加(P0.01),而EOFAZ预保护1 h后可明显使HG诱导的凋亡率下降(P0.01)。HG处理后HUVECs胞浆和线粒体Bax蛋白表达相较对照组均有所上调,但线粒体Bax蛋白表达上调的程度更为显著(P0.01),证明大量的Bax蛋白从胞浆转位至线粒体。在EOFAZ组及Cyclosporin组胞浆Bax和线粒体Bax蛋白表达相较HG组均下降。3.与对照组细胞相比较,当siRNA SIRT1浓度为30nmol/L时SIRT1 mRNA下降作用最为明显(P0.01),因此随后实验选用30 nmol/L作为siRNA的转染浓度。用Western blot检测后发现,与对照细胞组相比Si RNA SIRT1转染后HUVECs SIRT1蛋白表达水平显著下降(P0.01),caspase-3蛋白水平明显上调(P0.01),而SiRNA阴性转染组和对照组相比细胞SIRT1和caspase-3蛋白表达无显著性差异(P0.05)。siRNA SIRT1转染细胞后,LDH外漏率显著高于对照组(P0.01),并且可显著促进HG诱导的HUVECs LDH外漏(P0.01)。而EOFAZ预孵育1 h可以显著减少siRNA SIRT1转染诱导的LDH外漏(P0.01)。为了确定EOFAZ对siRNA SIRT1诱导的HUVECs炎症因子表达的影响,使用ELISA测量TNF-α和IL-8的水平,siRNA SIRT1转染细胞后TNF-α和IL-8的水平显著高于对照组(P0.01),且可显著促进HG诱导的HUVECs TNF-α和IL-8的水平(P0.01)。EOFAZ预孵育1 h可以显著减少siRNA SIRT1转染诱导的炎症因子水平(P0.01)。Western blot及RT-PCR检测显示HG刺激可显著抑制SIRT1 mRNA和蛋白的表达(P0.01),siRNA SIRT1转染可使HG介导的SIRT1 mRNA和蛋白表达进一步下降(P0.01),采用EOFAZ预保护可使HG及siRNA SIRT1转染诱导的SIRT1 mRNA和蛋白表达显著增加(P0.01)。荧光显微镜显示正常HUVECs中线粒体表现为典型的融合长条状,而受损线粒体形态则转变为分散的小圆粒状(fission),siRNA SIRT1刺激后可见含fission线粒体的细胞数量明显增多(P0.01),EOFAZ预保护可使细胞fission线粒体数量明显减少(P0.01)。si RNA SIRT1处理可显著下调Mfn2蛋白并上调Drp1的表达(P0.01),且可使HG介导的Mfn2蛋白表达进一步下调,与HG组比较差异有统计学意义(P0.05),并使Drp1蛋白显著上调(P0.01)。EOFAZ预处理可显著上调siRNA SIRT1诱导的Mfn2表达下降(P0.01),且可显著下调Drp1的表达(P0.01)。siRNA SIRT1转染后显著降低HUVECs ATP含量(P0.01),且可使HG介导的ATP含量进一步下降,与HG组比较差异有统计学意义(P0.05),而用EOFAZ干预后内皮细胞ATP含量明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。siRNA SIRT1转染后显著降低HUVECs PGC-1α含量(P0.01),且可使HG介导的PGC-1α含量进一步下降(P0.01),予EOFAZ预孵育可显著上调siRNA SIRT1引起的内皮细胞PGC-1α含量下降(P0.01)。siRNA SIRT1可显著上调HUVECs p65和IkBα蛋白表达,且显著激活p65磷酸化即上调p-p65的表达(P0.01)。HG可使HUVECs乙酰化NF-κB p65蛋白表达显著增加(P0.01),siRNA SIRT1组HUVECs NF-κB p65蛋白乙酰化水平较HG组显著上调(P0.01)。EOFAZ干预则可以显著降低HG组及siRNA SIRT1组NF-κB p65蛋白乙酰化水平(P0.01)。结论:1.EOFAZ可以通过抑制NF-κB的激活改善HG诱导的HUVECs功能障碍。2.HG通过诱导MPTP开放、线粒体生物合成障碍及激活线粒体凋亡途径导致HUVECs线粒体损伤,EOFAZ对HG诱导HUVECs线粒体功能障碍具有抑制作用。3.EOFAZ可上调SIRT1的表达,对siRNA SIRT1引起的HUVECs线粒体损伤具有抑制作用。下调SIRT1表达可以通过影响NF-κB p65蛋白乙酰化水平激活NF-κB通路,EOFAZ可以调控SIRT1/NF-κB通路改善HG引起的血管内皮细胞功能障碍。EOFAZ作为SIRT1激活剂为寻找有效防治DM血管病变提供了新的药物和思路。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

倒置显微镜,生长细胞,形态学特征,梭形

倒置显微镜下HUVECs正常形态：100×Fig.1-1Normalmorphologyofhumanumbilicalveinendothelialcellswithinverted

实验测定,学位论文,医科大学,甘露醇

贵州医科大学 2018 届科学学位博士研究生学位论文显著降低高水平的 LDH 外漏（P<0.01）。为了消除高渗性对 HG 诱导的 LDH漏增加的影响，将 35mmol / L 甘露醇（Mannitol）替代 HG 处理细胞，可见 Mann对 LDH 外漏没有影响，见图 1-2D。

艳山姜挥发油对高糖诱导人脐静脉内皮细胞线粒体功能障碍的保护作用

HE染色：100×Fig.1-3HEstaining：100×

【参考文献】