臭灵丹酸抗流感病毒及抗炎作用机制研究

发布时间：2020-07-20 20:25

【摘要】：目的:将来自于云南传统药物臭灵丹具有抗流感病毒的活性成分C8(倍半萜类混合物)作进一步的组分分析,并分离出具有抗病毒成分的化学单体。研究化学单体对于不同亚型流感病毒的抑制作用,并进一步研究其对于流感病毒复制周期不同环节的阻断作用强度,同时明确单体对于流感病毒感染引起的相关宿主信号通路和细胞因子、趋化因子的转录水平和蛋白水平的变化,从而阐明化学单体抗流感病毒及病毒引起相关炎症的作用机制,为臭灵丹的临床用药提供基础研究参考。方法:利用超高效液相色谱对臭灵丹的C8(倍半萜类混合物)成分进行组分分析和定量,并通过硅胶柱层析进一步分离化学单体。对于分离化学单体,以细胞病变法进行不同呼吸道病毒和不同亚型流感病毒的体外药效筛选,并针对筛选有效的单体开展预防、治疗和直接作用的三个药效作用模式筛选,并利用血凝抑制试验、病毒聚合酶活性抑制试验、NF-КB激活试验、免疫荧光试验和神经氨酸酶活性抑制试验等5个试验鉴别单体抗病毒药效作用于流感病毒的生活复制周期的具体环节,最后利用荧光定量PCR技术寻找单体对于流感感染引起的主要细胞因子和趋化因子mRNA表达的抑制作用,并通过Bio-Plex悬浮芯片系统在蛋白水平验证相关因子表达水平的变化规律。成果:(一)臭灵丹桉烷型倍半萜类化合物的分离、鉴定及抗病毒谱研究结果通过对C8进行硅胶柱层析反复分离,TLC指导合并(碘熏显色)得到化合物1,醋酸乙酯重结晶纯化得到化合物2,经过超高效液相色谱和四重杆质谱联用技术测定化合物的含量分别为107.98mg/g和111.3mg/g。通过上述两个化合物进行核磁共振技术的鉴定,结果发现两个化合物1、2分别为臭灵丹酸和臭灵丹二醇。对臭灵丹酸和臭灵丹二醇的进行细胞毒性试验(MTT法)和抗呼吸道病毒药效筛选试验,结果发现两个化合物的最大无毒浓度分别为278.9μg/mL和100μg/mL,臭灵丹酸对不同亚型的甲型H1N1流感病毒均具有抑制作用,其对于甲型H1N1流感病毒PR8株、新甲型H1N1流感病毒California04株、新甲型H1N1流感病毒GIRD07株(临床分离株)的半数抑制浓度分别为37.14μg/mL、21.75μg/mL和9.47μg/mL,而对于其他H3N2、H7N3、H6N3和H9N2的人或禽流感均在最大无毒浓度下不显示抑制效应,而且对于呼吸道合胞病毒、I型单纯疱疹病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒16型均无抑制病毒复制的作用。为了更进一步确认臭灵丹酸对于流感病毒的抑制作用,本研究采用子代病毒减少试验检测不同浓度臭灵丹酸处理的流感病毒感染细胞后,细胞上清的子代病毒数量,结果发现其在25-100μg/mL的范围内对甲型H1N1流感病毒PR8株具有明显的抑制作用,而且与病毒对照组相比具有统计学差异(P0.01)。臭灵丹二醇对不同亚型的流感病毒以及其他呼吸道和肠道病毒在体外均不显示抗病毒作用。(二)臭灵丹酸抗甲型流感病毒的作用机制研究通过对臭灵丹酸抗甲型H1N1流感病毒的药物作用模式检测,结果显示其对于病毒颗粒没有抑制作用,对于细胞没有保护预防作用,只有在治疗模式下可以发挥抑制病毒作用,其半数有效浓度为35.93μg/mL。此外,针对病毒复制周期不同的靶点,开展了臭灵丹酸作用靶点研究,在血凝抑制试验证实该化合物对于流感病毒血凝素没有抑制作用。在神经氨酸酶活性抑制试验发现臭灵丹酸在668.1μg/mL浓度下对于新甲型H1N1流感病毒California04株的神经氨酸酶具有轻度的抑制作用,表明其可以通过抑制神经氨酸酶的活性来阻止子代病毒的释放。对流感病毒复制的关键位点-病毒聚合酶活性进行抑制试验结果显示,臭灵丹酸在10-80μg/mL范围内对甲型H1N1流感病毒的聚合酶活性具有轻度抑制作用。由于NF-КB信号通路活化对于流感病毒复制非常关键,因此本研究开展了对该通路活化的抑制试验,结果发现当臭灵丹酸浓度达到20-80μg/mL的时候,无论是由流感病毒或者是TNF-α刺激的NF-КB通路活化的作用均可被抑制。由于NF-КB通路被抑制以后,会导致病毒不能发生核输出,而被滞留在细胞核内,因此本研究为了进一步验证臭灵丹酸对NF-КB通路活化的抑制作用,开展了流感病毒蛋白核输出实验,在荧光显微镜下发现臭灵丹酸处理后的病毒感染细胞,其病毒核蛋白无法通过细胞核输出,导致其滞留于细胞核内,没有办法产生子代病毒。(三)臭灵丹酸对宿主流感感染相关细胞因子变化的作用研究由于臭灵丹酸的仅能抑制甲型H1N1流感病毒,对病毒的神经氨酸酶和聚合酶具有轻度抑制作用,但是能明显抑制病毒感染引起的NF-КB通路的活化,因此本研究进行了相关炎症因子的表达研究,结果发现在mRNA水平上,该化合物在25-100μg/mL浓度下能明显抑制甲型H1N1病毒PR8株感染所致的IP-10、MIP-1β和IL-6的mRNA表达升高,在100μg/mL下能抑制MCP-1的表达升高;在25-100μg/mL浓度下能明显抑制甲型H9N2禽流感病毒感染所致的IP-10和MIP-1β的表达升高,在100μL/mL浓度下能明显抑制CCL-5和TNF-α的表达升高。为了进一步确认其对于炎症因子的抑制效应,本研究在蛋白水平上利用bio-plex平台检测相关细胞因子的蛋白表达变化情况,结果显示臭灵丹酸在25-100μg/mL浓度下能明显抑制甲型H1N1病毒PR8株感染所致IP-10和IL-6的蛋白水平升高,在100μg/mL浓度下抑制TNF-α的蛋白表达水平升高;在25-100μg/mL浓度下能明显抑制甲型H9N2禽流感病毒感染所致的IP-10和IL-6的蛋白表达水平升高,在100ug/mL浓度下能明显抑制CCL-5和TNF-α的蛋白表达水平升高。结论:从臭灵丹的倍半萜类混合物中分离两个主要成分臭灵丹酸和臭灵丹二醇,证实臭灵丹酸在体外具有抗甲型H1N1流感病毒的作用,并且该作用是通过抑制神经氨酸酶和病毒聚合酶活性,以及病毒核蛋白输出而实现的,此外该化合物还能有效抑制人或禽流感感染引起的炎症因子的升高。臭灵丹二醇对于流感病毒、呼吸道合胞病毒及肠道病毒均无抑制作用。药效结果表明臭灵丹酸的直接抗病毒作用不强,而且只对甲型H1N1流感有效,但是其对于病毒感染引起的相关宿主的细胞因子、趋化因子的信号通路具有很好的抑制作用,而且不受甲型流感病毒亚型的限制,可以考虑作为流感感染相关免疫反应调节剂做进一步的研究和开发。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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