基于“血脉双治”理论的中药复方XXT分子药理学和代谢组学研究

发布时间：2020-07-20 20:40

【摘要】：本论文基于“血脉双治”理论,采用现代分子药理学和代谢组学技术对中药复方XXT片(Xueshuan Xinmaining Tablet,XXT)开展了“治血”和“治脉”的活性研究,并从基因和蛋白调控以及代谢途径等方面进行了机制探讨。阐明了XXT可通过调控F13a1,Car1和Tbxa2r等基因来调节机体血流状态,而起到抗血液循环内阻的作用;另通过上调Keap1、Nrf2、HMOX1、GCLM和NQO1等Nrf2信号通路的蛋白表达,发挥抗血管内皮细胞损伤的作用;进一步通过代谢组学研究发现,XXT通过作用于类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢和脂类代谢等3条信号通路而发挥“血脉双治”的作用;筛选出6个对抗凝血因子Xa(FXa)选择性较高的化合物。本论文取得的创新性成果如下:1.首次采用药效学开展了XXT改善血流状态的“治血”研究,结果显示XXT可显著降低全血粘度、血浆粘度、红细胞比容、EAI、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)等血流变和凝血指标,证明了XXT具有良好的抗血液循环内阻的作用。2.采用PCR Array技术,利用Matlab软件对数据进行聚类分析,首次对XXT改善血流状态的作用机制进行了探讨。结果表明:与正常组比较,模型组有373条基因表达显著上调,62条基因表达显著下调;与模型组比较,XXT组有307条基因表达显著上调,194条基因表达显著下调,差异表达基因主要涉及细胞周期、细胞凋亡、有丝分裂、细胞迁移及增值、免疫调节等细胞信号传导途径;F13a1,Car1和Tbxa2r等基因在模型组显著上调,而在XXT预处理后显著下调,说明XXT可通过调控这些基因而起到改善血流状态的作用。3.采用MTT比色法测定人脐静脉内皮细胞(HUVECs)存活率;采用FACS Calibur流式细胞术检测活性氧(ROS)的水平,首次证明了XXT抗血管内皮细胞氧化损伤的活性。4.采用PCR Array、Real-Time PCR和Western Blotting技术,首次探讨了XXT抗血管内皮细胞氧化损伤的作用机制。结果发现XXT可显著调控Nrf2及其下游基因的转录调控,且呈剂量依赖性;XXT通过上调Keap1、Nrf2、HMOX1、GCLM和NQO1等Nrf2信号通路的蛋白表达而起到抗血管内皮细胞氧化损伤的作用。5.采用UPLC-Q/TOP-MS技术结合多变量统计分析,首次完成了XXT的代谢组学研究,揭示了XXT通过调控类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢和脂类代谢等内源性代谢物通路而起到治疗作用。首次发现了血瘀证可引起机体体内类固醇生物合成的紊乱,而复方中药可通过调控这条物质合成途径,改善血瘀证,为血瘀证的治疗提供了一个新的靶点和新的思路。6.采用显色底物法,首次从XXT复方的14个Q-Markers物质及有效成分中筛选出了芦丁、丹酚酸B、绿原酸、人参皂苷Rg3、-Rg2和原人参三醇等6个选择性较高的FXa的活性成分,应用Schr?dinger软件中的Glide XP模块对各抑制剂与FXa进行分子对接,进一步模拟各活性成分与FXa之间的相互作用。上述创新性成果,充分说明了XXT的“血脉双治”分子药理活性及其作用机制,为复方中药XXT的二次开发奠定了坚实的基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

总RNA提取,甲醛,琼脂糖凝胶电泳,条基

图 3.1 总 RNA 提取后甲醛变性琼脂糖凝胶电泳图ig. 3.1 The formaldehyde-induced agarose gel electrophoresis (SDS-PAGafter total RNA extraction异基因筛选及聚类分析实验通过比较芯片 cy5 和 cy3 的 Ratio 值并结合各生物学重复 Ratio 的出表达基因，筛选差异表达 2 倍以上的基因为差异基因。模型组与正 N）相比，有 435 个基因差异表达，其中 373 条基因出现显著表达上因出现显著表达下调；而给药组与模型组相比（Y vs M），有 501 个表达，其中 307 条基因出现显著表达上调，194 条基因出现显著表达下表达基因进行层次聚类，如图 3.2 所示。图中的四张芯片分别是 M1 vs2、Y1 vs M1、Y2 vs M2。图中的差异基因主要可以分成四个区域，

差异表达基因,样本,聚类,芯片

图 3.2 差异表达基因与样本芯片的二维聚类Fig. 3.2 Hierarchical clustering of the differentially expressed genes.注：图中的横向 4 列为芯片样本进行聚类，编号为样本名称，纵向为差因进行聚类。标注为不同颜色表示的上调及下调基因及其差异倍率.3 差异基因功能分析及 pathway 分类对差异基因进行功能分析发现，血瘀模型中 8 个表达上调的基因在 XX出现表达下调。3 个血瘀模型中出现表达下调的基因在 XXT 治疗后出调，见表 3.6。我们分析了这些基因的功能，发现许多基因与凝血相关a1, Car1 和 Tbxa2r。使用 David 数据库对表达显著差异的基因（Fold ch进行 KEGG 及 GO pathway 富集分析。其中差异表达基因主要涉及细胞周

生化技术,基因芯片技术,高新科技,微电子学

图 3.3 F13a1, Car1 及 Tbxa2r 的 mRNA 表达水平Fig. 3.3 The mRNA expression of F13a1, Car1 and Tbxa2r芯片，又称 DNA 芯片(DNA Chips)、DNA 微阵列（DNA Microa因探针或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或，形成致密有序的 DNA 分子点阵，按碱基配对的特性与样品 D过计算机进行解读和分析获取大量信息，实现对生物样品高效医学诊断，是综合微电子学、物理学、生化技术及生命科学等众综合的高新科技。基因芯片因其具有快速、高效、大规模、高容等特点，被广泛的推广使用。基因芯片技术的原理是先将已知核

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