息风药全蝎对肝癌转移的影响和肝癌细胞EMT作用的研究

发布时间：2020-07-20 21:26

【摘要】：前言肝癌在我国是致死率居第三位的恶性肿瘤,其中肝癌转移又是导致肝癌患者高死亡率的主要原因之一,因此防治癌肿转移成为肝癌相关研究领域的热点科学问题。近年有学者提出“内风”是引起肿瘤转移的重要病机,已有报道显示常用息风类中药具有一定的抗肿瘤作用,并广泛应用于多种恶性肿瘤的辅助治疗,但具体机制尚未明确。本研究分别从在体和离体实验两方面,观察息风药全蝎对肝癌转移的影响和对肝癌细胞EMT的作用,探讨其可能作用机制。为全蝎在临床防治肝癌转移的应用提供实验依据。实验一全蝎对体内肝癌生长和转移的影响【目的】观察单味息风药全蝎水煎剂对荷瘤鼠体内肝癌生长和转移的影响,以及对发生转移的组织EMT相关标志蛋白的作用。【方法】将实验用裸鼠分为模型组、全蝎组和空白对照组,其中模型组和全蝎组裸鼠通过尾静脉注射法,在体内接种稳定表达荧光素酶Luciferase的肝癌细胞Hepa1-6,建立肝癌转移模型,空白对照组不进行细胞接种。一周后全蝎组裸鼠以全蝎水煎剂(全蝎含药量0.091g/20g)进行灌胃,模型组和空白对照组则分别以等体积磷酸缓冲盐溶液(PBS)灌胃。观察各组动物一般情况,并通过活体成像系统记录各组动物体内肝癌转移灶数量及大小;通过苏木素伊红(HE)染色对不同实验组裸鼠肺脏及肝脏进行形态学观察;通过免疫组化染色和蛋白印迹分析的方式,观察比较各实验组肺组织肿瘤病变区域EMT相关标志蛋白的改变。【结果】实验过程中各组裸鼠体重变化无明显差异,4周内均未出现死亡现象。全蝎组裸鼠体内肿瘤转移灶荧光信号在数量、面积和强度等各方面均明显低于模型组(P0.05);HE染色可见全蝎组裸鼠肺脏、肝脏病变区域组织形态与模型组相同,但癌巢数量和面积均明显小于模型组(P0.05);免疫组化染色结果提示与全蝎组比较,模型组肺组织E-cadherin染色明显减少,N-cadherin染色显著增加;蛋白印迹分析进一步明确与空白对照组比较,模型组肺组织E-cadherin表达水平显著降低(P0.001),N-cadherin表达水平显著升高(P0.001),说明模型组肺组织发生EMT改变;而与同期模型组比较,全蝎组肺组织E-cadherin表达量显著增加(P0.001),而N-cadherin表达量则明显降低(P0.01),说明全蝎干预后肺组织肿瘤灶内EMT状态发生了转变。【结论】息风药全蝎对荷瘤鼠体内肿瘤的形成、生长和转移均表现出有效的抑制作用,并明显抑制了相关组织EMT的状态;同时全蝎对实验鼠作用过程中未表现出明显的毒副反应。实验二全蝎对肝癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响【目的】观察单味息风药全蝎含药血清对鼠源性肝癌细胞Hepa1-6体外增殖、凋亡活性和侵袭、迁移能力的影响。【方法】将40只实验用SD大鼠随机分为对照组和全蝎组,每组各20只。其中全蝎组大鼠每100g体重每天予全蝎水煎剂灌胃量为315ml(含全蝎0.315g),对照组给予等体积PBS灌胃,连续灌胃3天后采血,制备全蝎含药血清和对照血清。将肝癌细胞Hepa1-6分为对照组和全蝎组,分别给予对照血清和全蝎含药血清培养。通过EdU染色检测细胞的增殖、TUNEL荧光染色检测细胞凋亡、细胞划痕实验检测肝癌细胞体外迁移能力、Transwell小室法检测不同含药血清干预下细胞的侵袭能力。【结果】与对照组细胞相比较,全蝎组EdU标记的阳性增殖细胞数明显减少(P0.01),而TUNEL标记的凋亡细胞数则显著增多(P0.001);同时全蝎组肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力与对照组相比也均明显降低(P0.001、P0.05)。【结论】息风药全蝎可有效降低肝癌细胞Hepa1-6体外的增殖活性,诱导促进其凋亡,并对细胞的侵袭和迁移能力有明显的抑制作用。实验三全蝎对肝癌细胞EMT的影响【目的】通过构建肝癌细胞EMT模型,进一步研究息风药全蝎对肝癌细胞及组织EMT过程产生的具体作用影响和潜在作用机制。【方法】将肝癌细胞Hepa1-6分为模型组、全蝎组和对照组,其中模型组和全蝎组细胞分别加入鼠源性TGF-β1(10ng/mL)诱导72h,诱导的同时模型组给予对照血清干预,全蝎组给予全蝎含药血清干预;而对照组细胞不进行TGF-β1诱导,仅给予对照血清干预。采用qRT-PCR和Western Blot对比各组细胞EMT相关标志蛋白和转录因子的变化,并进一步通过免疫组化染色和蛋白印迹分析的方式检测实验一中裸鼠组织样本相关EMT转录因子的变化。【结果】qRT-PCR和Western Blot均显示:与空白组比较,模型组细胞E-cadherin下调(P0.01),N-cadherin上调(P0.001);与模型组比较,全蝎组E-cadherin显著提高,而N-cadherin则大幅下降(P0.05)。同时药物全蝎干预前后各组细胞中EMT相关转录因子Snail的变化趋势最为显著,且差异具有统计学意义;免疫组化染色提示与模型组比较,全蝎组肺组织Snail因子染色区域显著减少;蛋白印迹法进一步检测并比较荷瘤鼠肺组织转录因子Snail的表达情况发现:模型组肺组织snail因子的蛋白表达水平明显增加(P0.01),而全蝎组肺组织内Snail的表达水平则显著下调(P0.01),说明全蝎对模型鼠体内EMT相关转录因子Snail的表达发挥负向调节作用。【结论】息风药全蝎可能通过抑制转录因子Snail的表达,对EMT过程发挥负向调节作用,有效减弱肝癌细胞侵袭能力并抑制肝癌的进一步转移,为息风药全蝎在临床防治肝癌转移的应用提供实验依据。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

肝癌转移,体重变化,实验组,情况

1-1 不同实验组肝癌转移模型鼠体重变化情况c+细胞后不同实验组裸鼠体重变化经比较无明显癌荷瘤小鼠肿瘤转移体成像系统发现，细胞接种 2 周后方可检测到 4 周作为时间点对荷瘤小鼠体内肿瘤信号进行实验组裸鼠体内肿瘤细胞生长情况和转移灶形成1-2A 所示：药物干预 2 周后可见，模型组 8 只积、强荧光信号的肿瘤灶改变，而全蝎组 8 只病变区域在数量、面积和所表达荧光信号的强干预 4 周后观察发现，模型组 8 只裸鼠体内全多、面积大、荧光信号强烈，而全蝎组仅 6 只Days after intravenous inoculation

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图 1-3 苏木素伊红（H&E）染色检测肝癌转移模型鼠组织形态学改变鼠肝癌转移模型建立后分别采用全蝎水煎剂和 PBS 进行灌胃治疗，各组裸肝脏组织 H&E 染色结果，下行图片为上行图片中红框内容的放大部分。比例μm；B) 各组荷瘤鼠肺脏转移瘤数量统计和比较，*P<0.05；C) 各组荷瘤鼠瘤面积统计和比较，*P<0.05。息风药全蝎抑制肝癌 EMT我们通过免疫组化染色的方式，观察比较各实验组肺组织肿瘤病变区域上充质转化的程度和状态。如图 1-4A 所示，棕色区域即为所检测的目的蛋白区域。镜下观察可以发现：在模型组裸鼠肺组织中代表上皮细胞标志dherin 几乎没有显色，而在全蝎组裸鼠肺组织中，其阳性显色区域明显增加模型组裸鼠肺组织中，代表间充质细胞标志物的 N-cadherin 显色非常明显组的 N-cadherin 阳性染色面积则大幅减少。说明药物全蝎干预 4 周后，肺ControlScorpionControlScorpionR

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空军军医大学硕士学位论文深，而 N-cadherin 的条带则明显变浅。如图 1-4C 所示，对各组条带进行灰统计分析发现：与空白对照组比较，模型组 E-cadherin 表达水平显著<0.001），N-cadherin 表达水平显著增高（P<0.001），说明模型组发生 EMT 转期模型组相比较，全蝎组裸鼠肺组织 E-cadherin 表达量显著增加（P<0.001）adherin 表达量则明显减少（P<0.01）。说明息风药全蝎干预 4 周后肺组织肿MT 状态发生了变化。

【参考文献】