氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导肝细胞损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-07-22 02:59

【摘要】：目的:1.观察阿戈美拉汀(Agomelatine,AMT)对L02肝细胞的损伤作用并探讨其机制。2.观察氧化苦参碱(Oxymatrine,OMT)对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的保护作用并探讨其机制。方法:1.观察阿戈美拉汀对L02肝细胞的损伤作用给予不同浓度的阿戈美拉汀后,在不同时间点观察药物对L02肝细胞的损伤作用。(1)CCK-8检测阿戈美拉汀对L02肝细胞活力的影响。(2)谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)检测阿戈美拉汀对L02肝细胞损伤程度的影响。(3)流式细胞术检测阿戈美拉汀对L02肝细胞凋亡的影响。2.探讨阿戈美拉汀对L02肝细胞的损伤作用与内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激的关系(1)给予50μM的阿戈美拉汀后,在不同时间点观察,阿戈美拉汀对L02肝细胞内质网应激相关蛋白的作用。Western blot检测p-AKT以及内质网应激相关蛋白BIP,p-IRE1α,ATF6,CHOP和p-eIF2α的变化。(2)给予不同浓度的阿戈美拉汀后,在24 h观察,阿戈美拉汀对L02肝细胞内质网应激相关蛋白的作用。Western blot检测p-AKT以及内质网应激相关蛋白BIP,p-IRE1α,ATF6,CHOP和p-eIF2α的变化。(3)预孵育2.5,5,10 nM的PERK通路抑制剂ISRIB 1 h后,给予L02肝细胞50μM阿戈美拉汀24 h,CCK-8检测L02肝细胞活力。3.观察氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的保护作用预孵育0.5,1,2μM的氧化苦参碱18 h后,给予L02肝细胞50μM阿戈美拉汀24 h。(1)CCK-8检测氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的细胞活力的影响。(2)ALT和AST检测氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的细胞损伤程度的影响。(3)流式细胞术检测氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的细胞凋亡的影响。(4)TUNEL染色检测氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的细胞凋亡的影响。4.探讨氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的保护作用与CHOP蛋白的关系(1)预孵育0.5,1,2μM的氧化苦参碱18 h后,给予L02肝细胞50μM的阿戈美拉汀24 h。Western blot检测BIP,p-IRE1α,ATF6,CHOP和p-AMPKα的变化。(2)细胞热迁移法检测氧化苦参碱对AKT蛋白的热稳定作用。(3)SURFLEXDOCK软件计算氧化苦参碱和AMPK蛋白的分子对接打分。(4)分别给予L02肝细胞1μM MG132,25μM CQ和50 nM BafA1 1 h。Western blot检测CHOP蛋白的变化。(5)预孵育0.5,1,2μM的氧化苦参碱18 h,给予L02肝细胞50μM阿戈美拉汀之前,给予1μM MG132处理1 h。Western blot检测CHOP蛋白的变化。结果:1.阿戈美拉汀对L02肝细胞的损伤作用(1)CCK-8结果表明,与对照组相比,给予L02肝细胞高于100μM的阿戈美拉汀12 h,细胞存活率显著降低;给予L02肝细胞高于50μM的阿戈美拉汀24 h,细胞存活率显著降低;给予L02肝细胞高于10μM的阿戈美拉汀48 h,细胞存活率显著降低。(2)ALT和AST结果表明,与对照组相比,给予L02肝细胞高于50μM的阿戈美拉汀24 h,ALT和AST的绝对值显著升高;给予L02肝细胞高于20μM的阿戈美拉汀48 h,ALT和AST的绝对值显著升高。(3)流式细胞术结果表明,给予L02肝细胞高于20μM的阿戈美拉汀24 h,与对照组相比,细胞凋亡率显著升高。2.阿戈美拉汀对L02肝细胞的损伤作用与内质网应激的关系(1)Western blot结果表明,与对照组相比,给予L02肝细胞50μM浓度的阿戈美拉汀24 h,BIP,p-IRE1α,ATF6和CHOP蛋白显著升高,p-AKT蛋白显著降低,p-eIF2α蛋白无显著变化。(2)Western blot结果表明,与对照组相比,给予L02肝细胞高于50μM的阿戈美拉汀24 h,BIP,p-IRE1α,ATF6和CHOP蛋白显著升高,p-AKT蛋白显著降低,p-eIF2α蛋白无显著变化。(3)CCK-8结果表明,给予L02肝细胞2.5,5,10 nM的PERK通路抑制剂ISRIB,与阿戈美拉汀实验组相比,细胞存活率无显著变化。3.氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的保护作用(1)CCK-8结果表明,给予L02肝细胞0.5,1,2μM的氧化苦参碱18 h,与模型组相比,细胞存活率显著升高。(2)ALT和AST检测结果表明,给予L02肝细胞0.5,1,2μM的氧化苦参碱,与模型组相比,ALT和AST绝对值显著降低。(3)流式细胞术结果表明,给予L02肝细胞2μM的氧化苦参碱18 h,与模型组相比,细胞凋亡率显著降低。(4)TUNEL染色结果表明,给予L02肝细胞1,2μM的氧化苦参碱18 h,与模型组相比,细胞凋亡率显著降低。4.氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导L02肝细胞损伤的保护作用与CHOP蛋白的关系(1)Western blot结果表明,给予L02肝细胞1,2μM的氧化苦参碱18 h,与模型组相比,只有CHOP蛋白水平显著降低,而BIP,p-IRE1α和ATF6蛋白水平无显著变化。(2)细胞热迁移结果表明,氧化苦参碱未能保持AKT蛋白的热稳定性。(3)SURFLEX-DOCK结果表明,氧化苦参碱和AMPK蛋白的结合力,远低于其激动剂A-769662和抑制剂PKA的结合力。(4)Western blot结果表明,与对照组相比,MG132可显著升高CHOP蛋白,而CQ和BafA1对CHOP蛋白没有影响。(5)Western blot结果表明,与模型组相比,给予2μM的氧化苦参碱18 h,CHOP蛋白水平显著降低,而MG132可逆转氧化苦参碱对CHOP蛋白水平的降低。结论:1.阿戈美拉汀对L02肝细胞有损伤作用。2.阿戈美拉汀通过激活内质网应激的IRE1α-CHOP和ATF6-CHOP通路诱导L02肝细胞损伤。3.氧化苦参碱对阿戈美拉汀诱导的L02肝细胞损伤有保护作用。4.氧化苦参碱经由蛋白酶体途径降解CHOP蛋白,从而对阿戈美拉汀诱导的L02肝细胞损伤起到保护作用。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

肝细胞,活力,损伤作用,学位论文

士学位论文结果对 L02 肝细胞的损伤作用对 L02 肝细胞活力的影响肝细胞不同剂量（10, 20, 50, 100, 200 μM）的阿戈（12,24,48h）观察药物对肝细胞的损伤作用。CC 100μM 的阿戈美拉汀 12h 后，L02 肝细胞的存活）；给予大于 50μM 的阿戈美拉汀 24h 后，L02 肝低（p<0.05）；给予大于 10 μM 的阿戈美拉汀 48 h照组显著降低（p<0.001），见图 1A。

凋亡,对照组,肝细胞,肝细胞损伤

图 2. 阿戈美拉汀对 L02 肝细胞损伤程度的影响（，n=7）（注：A, B：ALT 检测图；C, D：AST 检测图；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,与对照组相比）1.3 阿戈美拉汀对 L02 肝细胞凋亡的影响分别给予 L02 肝细胞不同剂量（10,20,50,100μM）的阿戈美拉汀后，在 24h 观察药物对肝细胞的损伤作用。流式细胞术检测结果表明，给予 20μM 阿戈美拉汀 24h 后，L02 肝细胞的凋亡率（26.06±2.21%）较对照组（12.95±2.20%）显著升高（p<0.05）；给予 50 μM 阿戈美拉汀 24 h 后，L02 肝细胞的凋亡率（38.30±2.60%）较对照组（12.95±2.20%）显著升高（p<0.001）；给予 100μM 阿戈美拉汀 24h 后，L02 肝细胞的凋亡率（43.33±2.35%）较对照组（12.95±2.20%）显著升高（p<0.001），见图 3A, B。

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阿戈美拉汀对Al下6一CHOPZ

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