白术内酯Ⅲ对人结肠癌HCT-116细胞凋亡的诱导作用研究

发布时间：2020-07-22 04:31

【摘要】：目的:白术(Atractylodes)来源于菊科植物白术干燥根,主产于浙江、安徽、湖北、湖南等地,其性味甘、苦、温,具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎等功效。白术内酯Ⅲ(AtractylenolideⅢ)是白术的主要成分之一,许多研究发现,白术内酯Ⅲ具有明显的抗炎、抗肿瘤作用,但其能否抑制结肠癌细胞的增殖,能否诱导肿瘤细胞凋亡尚不清楚。本研究以人结肠癌HCT-116细胞作为研究对象,观察白术内酯Ⅲ对该肿瘤细胞增殖的作用,并探讨其对HCT-116细胞凋亡的影响及分子机制,旨在阐明其抗肿瘤作用机制,为白术内酯Ⅲ在肿瘤治疗,特别是临床应用于结肠癌的治疗提供科学的实验依据。方法:(1)白术内酯Ⅲ体外抗肿瘤活性筛选:CCK-8法检测不同浓度的白术内酯Ⅲ对人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HePG2、肾上腺嗜铬细胞瘤PC12、人胰腺癌细胞Panc-28、人结肠癌细胞HCT-116等肿瘤细胞增殖的抑制作用。(2)白术内酯Ⅲ干预浓度及作用时间的筛选:选择一定浓度梯度白术内酯Ⅲ(6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L)分别处理HCT-116细胞12 h、24 h、48 h,采用CCK-8法检测其细胞增殖的抑制作用,筛选白术内酯Ⅲ的干预浓度及最佳作用时间。(3)白术内酯Ⅲ对HCT-116细胞体外抗肿瘤活性的测定:具体将细胞分为阴性对照组、阳性对照组采用0.5μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)、白术内酯Ⅲ组(50、100、200μmol/L)。常规培养肿瘤细胞后,阴性对照组不做处理,阳性对照组采用0.5μg/mL 5-氟尿嘧啶处理24 h,白术内酯Ⅲ组分别采用50、100、200μmol/L浓度的白术内酯Ⅲ处理肿瘤细胞24 h,利用CCK-8法检测结肠癌HCT-116细胞增殖的影响。(4)Hoechst 33258染色检测白术内酯Ⅲ对结肠癌HCT-116细胞凋亡的影响:将细胞分为阴性对照组、阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)、白术内酯Ⅲ组(50、100、200μmol/L)。常规培养人结肠癌HCT-116细胞于六孔板中,阴性对照组不做处理,阳性对照组采用0.5μg/mL 5-FU处理24 h,白术内酯Ⅲ组分别采用50、100、200μmol/L浓度的白术内酯Ⅲ处理细胞24 h,采用Hoechst33258染色对细胞核着色,根据亮蓝色细胞比例分析结肠癌HCT-116细胞凋亡变化;(5)Annexin V-FITC流式细胞术分析白术内酯Ⅲ对人结肠癌HCT-116细胞凋亡率的影响:将肿瘤细胞分为阴性对照组,阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)白术内酯Ⅲ组(50、100、200μmol/L)。常规培养结肠癌HCT-116细胞于六孔板中,阴性对照组不做处理,阳性对照组采用0.5μg/mL 5-FU处理24 h,白术内酯Ⅲ组分别采用50、100、200μmol/L浓度的白术内酯Ⅲ处理肿瘤细胞24 h,按照试剂盒步骤处理细胞,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率以分析各浓度白术内酯对HCT-116细胞凋亡作用;(6)RT-PCR测定白术内酯Ⅲ处理人结肠癌HCT-116细胞后凋亡相关基因(Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9)的表达水平:将肿瘤细胞分为阴性对照组、阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)、白术内酯Ⅲ组(50、100、200μmol/L)。常规培养结肠癌HCT-116细胞于六孔板中,阴性对照组不做处理,阳性对照组采用0.5μg/mL 5-FU处理24h,白术内酯Ⅲ组分别采用50、100、200μmol/L浓度的白术内酯Ⅲ处理肿瘤细胞24 h,按照试剂说明书步骤处理细胞,采用Bio-rad实时定量PCR仪检测细胞凋亡相关基因的表达水平;(7)Western blot法检测白术内酯Ⅲ处理人结肠癌HCT-116细胞后凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9)表达的变化:将肿瘤细胞分为阴性对照组、阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)、白术内酯Ⅲ组(50、100、200μmol/L)。常规培养结肠癌HCT-116细胞于六孔板中,阴性对照组不做处理,阳性对照组采用0.5μg/mL 5-FU处理24 h,白术内酯Ⅲ组分别采用50、100、200μmol/L浓度的白术内酯Ⅲ处理肿瘤细胞24 h,按照试剂说明书步骤提取细胞蛋白,电泳、转膜、孵育一抗二抗,最后采用ECL化学发光仪检测PVDF膜上细胞凋亡相关蛋白表达水平,并用Bio-rad ChemiDoc?XRS+凝胶成像系统获取图像,Image J软件分析灰度值。结果:(1)体外抗肿瘤活性筛选:与对照组比较,不同浓度白术内酯Ⅲ(25、50、100、200μmol/L)对HePG2、Panc-28以及A549等肿瘤细胞活力无明显的抑制作用;白术内酯Ⅲ100、200μmol/L浓度干预PC12肿瘤细胞,可轻度抑制该细胞的增殖,但与对照组比较,差异无统计学意义。白术内酯Ⅲ各浓度(25、50、100、200μmol/L)干预人结肠癌HCT-116细胞后,细胞生长抑制率分别增加至16.71±1.38%、17.33±1.08%、34.55±3.14%、73.98±2.95%,与对照组比较,差异有统计学意义。(2)白术内酯Ⅲ干预浓度及作用时间的筛选:与对照组比较,白术内酯Ⅲ各浓度(6.25、12.5、25、50、100μmol/L)处理HCT-116细胞12 h后细胞增殖无明显变化,白术内酯Ⅲ200μmol/L处理HCT-116细胞12 h后细胞生长抑制率轻微增加,差异无显著性(P0.05);白术内酯Ⅲ6.25、12.5、25μmol/L处理HCT-116细胞24 h,细胞活力无明显变化,白术内酯Ⅲ50、100、200μmol/L处理细胞24 h,细胞生长抑制率显著增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);白术内酯Ⅲ各浓度(6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L)处理HCT-116细胞48 h,与对照组比较,细胞生长抑制率显著增加,差异有统计学意义(P0.05),并呈现一定的浓度依赖性。结果表明,后续实验白术内酯Ⅲ可采用干预浓度为50、100、200μmol/L进行,最佳作用时间为24 h。(3)白术内酯Ⅲ对HCT-116细胞体外抗肿瘤活性的测定:CCK-8法检测结果表明,与阴性对照组比较,阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)以及白术内酯Ⅲ各浓度组(50、100、200μmol/L)处理HCT-116细胞24 h,细胞生长抑制率显著增加,差异有统计学意义(P0.05)。(4)Hoechst 33258染色检测白术内酯Ⅲ对结肠癌HCT-116细胞凋亡的影响:阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)以及白术内酯Ⅲ各浓度组(50、100、200μmol/L)处理HCT-116细胞24 h,细胞核呈现亮蓝色的细胞比例显著增加,提示凋亡细胞增加,并呈现一定的浓度依赖性,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。(5)Annexin V-FITC流式细胞术分析白术内酯Ⅲ对结肠癌HCT-116细胞凋亡率的影响:阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)以及白术内酯Ⅲ各浓度组(50、100、200μmol/L)处理HCT-116细胞24 h,细胞凋亡率明显增加,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。(6)RT-PCR测定白术内酯Ⅲ处理结肠癌HCT-116细胞后凋亡相关基因表达的影响:阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)以及白术内酯Ⅲ各浓度组(50、100、200μmol/L)处理HCT-116细胞24 h,促凋亡基因Bax、caspase-9、caspase-3表达水平显著增加,抑凋亡基因Bcl-2表达水平明显降低,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。(7)Western blot法检测白术内酯Ⅲ处理结肠癌HCT-116细胞后凋亡相关蛋白表达的影响:阳性对照组(5-FU,0.5μg/mL)以及白术内酯Ⅲ各浓度组(50、100、200μmol/L)处理HCT-116细胞24 h,促凋亡蛋白Bax、caspase-9、cleaved caspase-3表达水平显著增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显降低,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论:(1)白术内酯Ⅲ对HePG2、Panc-28、A549、PC12等细胞增殖无明显抑制作用,但对人结肠癌HCT-116细胞增殖具有较强的体外抗肿瘤活性,最佳干预浓度为50、100、200μmol/L,最佳作用时间为24 h。(2)白术内酯Ⅲ能明显抑制HCT-116细胞增殖,诱导其凋亡,呈现出一定的浓度依赖性。(3)白术内酯Ⅲ可能通过调节Bax/Bcl-2凋亡信号通路,促进Bax、caspase-9、caspase-3等基因及Bax、caspase-9、cleaved caspase-3等蛋白表达,抑制Bcl-2基因及蛋白表达,从而促进HCT-116细胞发生凋亡。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285

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