桑椹多糖的结构鉴定及其生物活性研究

发布时间：2020-07-22 04:40

【摘要】：目的:桑椹(Fructus Mori)作为中国传统的药食两用中药药材,是桑科植物桑的干燥果穗,其多糖含量较高。近年来,越来越多的研究证明了大分子多糖的多种药理作用。本论文从大分子多糖入手,研究桑椹多糖的结构及其对肠道菌群和Aβ_(42)聚集的影响,以及桑椹多糖硫酸化衍生物抗血管生成的活性。尝试从多糖的结构与活性去研究中药桑椹,以期为桑椹基于多糖的物质基础和相关保健品及创新药物的研究奠定基础。方法:本论文利用干燥桑椹通过酶(纤维素酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶)联水提的方法提取桑椹粗多糖(FMP)。粗多糖FMP依次经DEAE-Fast Flow和Sephacryl S-300HR和Sephacryl S-100 HR分离纯化。将纯化所得的桑椹多糖经高效凝胶渗透色谱(HPGPC)分析纯度及其相对分子量。经3-甲基-1-苯基-2-吡啶啉酮(PMP)衍生法和糖醇乙酸酯衍生法分析其单糖组成,甲基化方法分析其糖残基连接方式、Conrad法进行糖醛酸还原,用三氟乙酸(TFA)进行部分酸水解,结合红外图谱(IR)、核磁共振(NMR)等多种方法确定多糖的结构。本论文采用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)对肠道拟杆菌(多形拟杆菌、卵形拟杆菌和脆弱拟杆菌)进行培养,研究桑椹多糖对肠道拟杆菌株的生长影响;以稳定转染淀粉样蛋白Aβ_(42)前体蛋白APP和β-分泌酶1-BACE1的中国仓鼠卵巢细胞(CHO/APPBACE1)和稳定转染Aβ_(42)前体蛋白APP的Swetish突变HEK293-APPsw细胞为主要的细胞模型,研究多糖对淀粉样蛋白Aβ_(42)生成的影响;采用硫磺素T结合实验测定桑椹多糖对Aβ_(42)聚集的影响;用MTT方法检测桑椹多糖对人正常肝细胞LO_2的毒性;采用氯磺酸-吡啶法(1:3)对桑椹多糖进行硫酸化衍生。人微血管内皮细胞(HMEC-1)在基质胶上的管腔形成实验用来考察桑椹多糖硫酸化衍生物的抗血管生成能力。结果:从桑椹中,提取得到桑椹粗多糖FMP(152 g,产率为15.2%)。继续分离纯化得到6种均一多糖FMP-2(500 mg,相对于原药材得率为0.05%)、FMP-5(4.67 g,得率为0.47%)、FMP-6-H(15.56 g,得率为1.56%)、FMP-6-S1(600 mg,得率为0.06%)、FMP-6-S2(2.5 g,得率为0.25%)和FMP-6-S4(1.71 g,得率为0.17%),HPGPC分析表明上述6种多糖都为均一多糖,分子量分别为12.6 kD、17.6 kD、17.5 kD、327.1kDa、86.83 kDa和11.23 kDa。对其中4个均一多糖(FMP-6-S2,FMP-6-S4,FMP-6-S1,FMP-6-H)进行详细的结构解析。FMP-6-S2的糖组成结果显示其由鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)组成,摩尔比为30.86:24.78:28.70:15.61。结合甲基化和核磁共振图谱结果分析,发现多糖FMP-6-S2为RG-I型多糖,其主链由1,4-α-D-GalpA与1,2-α-L-Rhap交替连接而成,支链由末端(Terminal)T-β-D-Galp,1,4-β-D-Galp,1,3,6-β-D-Galp,T-α-L-Araf和1,5-α-L-Araf构成;支链取代在鼠李糖的C-4位。FMP-6-S4为一个蛋白聚糖,主要由80%的多糖与20%的蛋白质组成,其中FMP-6-S4的多糖主要由半乳糖醛酸,阿拉伯糖,半乳糖,葡萄糖和鼠李糖组成,其摩尔比为62.13:4.50:3.70:3.87:5.80。通过氨基酸自动分析仪测出蛋白聚糖FMP-6-S4中的主要氨基酸成分有天冬氨酸,谷氨酸,甘氨酸,精氨酸,亮氨酸和脯氨酸,其摩尔比为4.33:7.27:1.77:1.99:1.61:3.11。蛋白聚糖FMP-6-S4中多糖的结构单元是以1→4连接的α-D-GalpA与1→2连接的α-L-Rhap为主链,而在α-D-GalpA的C-3位上被己烯糖醛酸(α-L-HexpA)和β-D-GalpA取代,在α-L-Rhap的C-4位上被α-L-Araf、1,5-α-L-Araf、β-D-Galp或β-D-Glcp、1,6-β-D-Glcp残基取代。糖组成分析结果表明FMP-6-S1由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖组成,其摩尔比为19.02:17.86:38.05:20.54:3.03:1.5。结合甲基化连接方式和核磁共振分析,结果表明FMP-6-S1与多糖FMP-6-S2类似,都为果胶类RG-I型多糖,但其分支结构不同,主链由1,4-α-D-GalpA与1,2-α-L-Rhap交替连接构成,在1,2-α-L-Rhap的C4位有支链,FMP-6-S1的支链由T-β-D-Galp(或Glcp),T-β-D-GlcAp,1,4,6-β-D-Galp,1,6-β-D-Galp,1,3-β-D-Galp,1,4-β-D-Galp,T-α-L-Araf和1,5-α-L-Araf构成。糖组成结果显示FMP-6-H主要由半乳糖醛酸(93.52%)及痕量的阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖组成,还原后甲基化分析表明其半乳糖醛酸的连接方式全部为1,4-连接,可直接推测FMP-6-H为一直链半乳糖醛酸聚糖。肠道菌群活性测试结果表明FMP-6-S2及其降解产物FMP-6-S2-01a可以促进有益菌多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的生长,进一步的研究表明多形拟杆菌可利用桑椹多糖FMP-6-S2或FMP-6-S2-01a产生短链脂肪酸乙酸和丁酸,短链脂肪酸不仅是肠道细菌的能量来源也可以为肠道粘膜细胞提供能量,对维持肠道稳态及机体免疫调节有重要的调控作用。抗Aβ_(42)产生与聚集活性实验结果表明,蛋白聚糖FMP-6-S4不但可以抑制Aβ_(42)聚集,而且可以显著抑制CHO/APPBACE1和HEK293-APPsw细胞中Aβ_(42)的分泌。抗血管生成活性试验表明FMP-6-S2和FMP-6-H的硫酸化衍生物在体外可以抑制HMEC-1细胞的管腔形成。结论:从桑椹中提取分离得到6种均一多糖(FMP-2,FMP-5,FMP-6-H,FMP-6-S1,FMP-6-S2和FMP-6-S4),它们大多为酸性多糖(FMP-2为中性多糖),且大多数为果胶类多糖,但其结构有差异。其中FMP-6-S1和FMP-6-S2都属于RG-I型多糖,FMP-6-S4为RG-II型蛋白聚糖,但其各自分子量和单糖组成不同,导致它们的活性也不同。多糖FMP-6-S2及FMP-6-S2-01a可以促进肠道优势菌群拟杆菌属的细菌生长,可以发挥改善肠道菌群的作用,也可为以肠道菌群为靶点,基于桑椹多糖调节肠道菌群的创新药物研究奠定了理论基础。FMP-6-H和FMP-6-S2的硫酸化衍生物均可明显抑制HMEC-1细胞的管腔形成。经体外实验证明,蛋白聚糖FMP-6-S4可以剂量依赖性地抑制稳定转染APP和BACE1的CHO/APPBACE1细胞和稳定转染APPSwetish突变的HEK293-APPsw细胞中Aβ_(42)的生成,并且浓度依赖性地抑制Aβ_(42)聚集。因此,蛋白聚糖FMP-6-S4可以是治疗阿尔兹海默症的先导化合物,具有开发成为一种治疗阿尔兹海默症的创新药物的潜力。综上所述,桑椹多糖可能是桑椹中药中治疗便秘和抗衰老的活性物质之一。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285
【图文】：

洗脱曲线,桑椹,粗多糖,提取流程

图 1-1 桑椹粗多糖提取流程2.2 粗多糖分离纯化2.2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow 分离桑椹酶联水提粗多糖分离纯化流程见图 1-2。每次称取 6 g 桑椹酶联水提粗多糖（FMP），使其充分溶解于 100 mL 去离子水中。将其离心后，取上清液，上样于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱（50 cm × 5 cm）。用去离子水和不同离子强度（0.05、0.1、0.2 和 0.3 M）NaCl溶液依次进行分布洗脱，采用自动部分收集器收集，根据硫酸苯酚法进行检测，绘制其洗脱曲线，将相同组分合并后，减压浓缩至小体积，透析（分子截留量 3,500 Da）两天后，减压浓缩透析袋内液后，冷冻干燥，依次得到组分 FMP-005，FMP-01，FMP-6-H 和 FMP-6（0.2 M NaCl 的洗脱液通过盐析分离），FMP-03。2.2.2 Sephacryl HR-100 或 Sephacryl S-300 HR 柱纯化桑椹粗多糖分离纯化流程见图 1-2。每次分别称取 200 mg 经 DEAE-Sepharose Fast Flow 分离

流程图,桑椹,粗多糖,分离纯化

图 1-2 桑椹粗多糖分离纯化流程2.3 桑椹多糖理化性质的测定2.3.1 桑椹多糖分子量和纯度多糖是一种多分散，结构上具有微观不均一性特点的复杂的生物大分子，其纯度标准不能采用小分子化合物的纯度标准来衡量。习惯上将均一多糖称为“纯”的多糖组分。均一多糖具有连续、正态分布的分子量和确定的糖组成和糖残基连接方式。常见的多糖纯度检测方法有比旋度法、超离心法、高压电泳法（如：聚丙酰胺凝胶电泳）和高效凝胶过滤色谱（HPGPC）。因操作比较省时、简便和准确度高等特点，使其HPGPC 法的应用最为广泛[70]。所以本课题采用 HPGPC 法测定桑椹多糖的纯度及其分子量。本课题桑椹多糖纯度测定条件如下：多糖凝胶色谱柱：将两根 UltrahydrogelTM802 （8.0 mm × 300 mm，排阻极限 1.0

标准曲线,含量测定,标准曲线,多糖

遵义医学院硕士学位论文李赛娟图 1，附图 2，附图 3，附图 4，附图 5 和附图 6），表明这 6 种多糖都为均一多糖，其分子量结果见表 1-4。3.2.2 多糖的中性糖含量根据硫酸-苯酚法测定中性糖含量，以葡萄糖的不同含量及其相对应的吸光度值（OD490）作标准曲线，如图 1-3，根据中性糖含量测定标准曲线计算出多糖样品的中性糖含量，其中均一多糖 FMP-2, FMP-5, FMP-6-H, FMP-6-S1, FMP-6-S2 和 FMP-6-S4的中性糖百分含量分别为 96.2%、32.6%、34.2%、91.8%、77.37%和 30%。结果见表1-4。

【参考文献】