8-十六烷基小檗碱抗肺癌作用及其机制研究

发布时间：2020-07-22 23:35

【摘要】：目的:肺癌是人类面临的最常见的恶性肿瘤之一。近年来,肺癌的发病率迅速上升,占全球所有癌症病例的十分之一以上,其死亡率亦位居全球癌症致死首位,严重威胁着人类的健康发展。尽管根据组织学分类,肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC),但约85%的肺癌患者被诊断为NSCLC。由于当前常用的抗肺癌药物效果欠佳、存在的毒副作用较大以及肿瘤细胞产生的抗药性,使得手术切除仍然是NSCLC最佳的治疗选择。然而,由于NCLSC发病早期无相关特异性症状,且当前对肺癌的发病分子机制仍不甚明了,缺乏针对NCLSC的准确及简易的早期诊断方法,以至于大多数肺癌患者被确诊时已处于手术切除已无法救治的病理晚期。因此,深入探究肺癌的发病分子机制,寻找新的有效早期筛查、预后标志物以及挖掘安全有效治疗肺癌的药物已是亟不可待。小檗碱(Berberine,BBR)又称为黄连素,是传统中药黄连的主要成分活性成分,广泛存在于小檗科、防己科、罂粟科等植物当中,长期在传统中药中被用于治疗胃肠道疾病。近年来,小檗碱及其衍生物被证明具有抗肿瘤活性且毒性较低,但其作用机制仍不明确。8-十六烷基小檗碱(8-BBR-C16,HBBR)是通过向BBR的C8位引入16C直链烷基修饰而产生的一种新BBR衍生物,课题组前期研究发现其口服吸收率、生物利用度较BBR显著增高,并且具有较明显的肺部靶向性,但其是否具有抗肺癌以及其它肿瘤活性仍未有报道。因此,一方面,本研究拟通过生物信息学的方法,筛选NSCLC相关差异表达基因,并通过差异蛋白间相互作用网络关系预测、核心基因筛选及预后分析等方面探讨非小细胞肺癌可能的分子机制。另一方面,通过体外及体内实验研究HBBR对肺癌的抑制作用及其可能的分子机制。方法和结果:(1)利用生物信息学方法以及GEO数据库中的人肺癌组织mRNA表达芯片数据集,我们比较分析了GSE21933、GSE33532、GSE44077和GSE74706数据集中NSCLC及其对应正常组织mRNA的表达水平,分别挖掘出差异上调基因:676、865、274、1797个;差异下调基因:761、1262、689、2350个;通过对四个芯片数据集差异表达基因取交集,最终获得差异上调基因57个以及138个差异下调基因。通过对差异基因进行GO(Gene Ontology)注释,发现上调的差异基因与细胞增殖、细胞分裂、细胞周期等生物学过程相关,下调差异基因与血管生成、细胞粘附、细胞凋亡等生物学过程相关。通过构建蛋白与蛋白相互作用(PPI)网络,挖掘出度得分≥19的中心节点基因25个,其中CCNB1、CCNA2、CEP55、PBK以及HMMR基因得分最高。通过Oncomine的肺癌数据库我们进一步对筛选得到的前5名中心节点基因进行了表达验证,并且通过Kaplan Meier Plotter的肺癌病人数据库进行预后分析后发现CCNB1、CCNA2、CEP55、PBK以及HMMR的mRNA表达水平高低与NSCLC的临床预后显著相关,并且其它20个中心节点基因也与NSCLC的临床预后紧密联系。(2)参考课题组前期的研究工作,利用格式试剂合成法,将16碳直链烷基取代BBR C8位的H合成HBBR。产物经结构鉴定,确定为拟研究目标产物。(3)为研究HBBR的体外抗肺癌作用,通过MTT方法分析了HBBR对于A549细胞的活力影响,发现HBBR较BBR对细胞活力的抑制作用大大提高,其半数抑制浓度(IC50)分别为2.325、27.398μg/ml;通过流式细胞仪检测不同浓度HBBR(0、0.2、0.5、1μg/ml)给药后A549细胞的周期分布,通过EdU增殖实验检测DNA合成以及western blot检测周期相关表达蛋白,发现HBBR能够抑制A549细胞的增殖,并且使其细胞周期阻滞于G0/G1期;运用流式细胞仪、TUNEL细胞凋亡检测以及western blot技术,我们发现HBBR亦能够通过诱导A549细胞发生凋亡而实现其抗肿瘤作用,并且通过分析HBBR给药后A549细胞中CEP55、PI3K、Akt、pAkt、p21、p27的蛋白表达水平后发现,HBBR极有可能通过抑制PI3K-Akt信号通路的活性而抑制细胞生长;同时,通过细胞划痕以及transwell细胞侵袭实验发现,HBBR能够显著抑制A549细胞的迁移与侵袭能力。(4)通过在裸鼠右前肢腋下皮下接种A549细胞建立人肺癌异种移植瘤模型,接种后通过口腔灌胃给药21天的方式研究HBBR的体内抗肺癌效果。实验结束时,与肿瘤模型组相比,药物组BBR(120 mg/kg)、HBBR(5 mg/kg)、HBBR(10 mg/kg)的平均离体瘤重分别降低27.47%、34.58%、59.07%。同时,通过肿瘤标志物蛋白芯片检测荷瘤21天后裸鼠的血清肿瘤标志物水平,发现HBBR给药后,NSE、CYFRA21-1和CA125水平显著降低。此外,通过检测给药期间裸鼠的体重变化以及解剖后各小鼠的脏器系数,发现HBBR长期给药对小鼠生长无明显毒副作用。以上结果表明,HBBR具有较好的体内抑制肺癌生长潜力,并呈现剂量依赖关系。(5)肠道内微生态的稳定与机体的健康及对疾病的抵抗能力息息相关,为从肠道微生物的角度探究HBBR抑制人A549肺癌细胞异种移植瘤生长的可能机制,收集动物实验第20天正常对照组、肿瘤模型组、HBBR(10 mg/kg)组小鼠新鲜排泄的粪便,提取粪便中的基因组DNA后,通过16S rRNA基因测序方法,检测各组肠道菌群的差异。从9个粪便样本中获得了685707个有效的焦磷酸测序读数,总共鉴定了198种微生物。结果发现肿瘤模型组小鼠体内检测到的微生物种类及丰度均低于正常对照组和HBBR组。表明HBBR的治疗有利于维持小鼠体内稳定和健康的微生态。在种水平上,本研究首次报道了HBBR给药有利于维持Clostridium clostridioforme(梭状梭菌)、Bacteroides acidifaciens(生酸拟杆菌)、Parabacteroides distasonis(迪氏副拟杆菌)、Lactobacillus animalis(动物乳杆菌)、Lactobacillus gasseri(格氏乳杆菌)、Lactococcus lactis(乳酸乳球菌)、Erysipelatoclostridium ramosum(多枝梭菌)以及Mucispirillum schaedleri在荷瘤小鼠肠道内的丰度。(6)采用人肺癌A549细胞荷瘤裸鼠模型和鼠源Lewis肺癌荷瘤模型同时比较HBBR单药、紫杉醇单药、紫杉醇联合顺铂以及紫杉醇联合HBBR对荷瘤小鼠肿瘤生长的作用效果,初步探究HBBR是否可以增强紫杉醇对肺癌细胞的杀伤作用。实验结果表明,在A549细胞荷瘤裸鼠模型中,HBBR(10 mg/kg)每日口腔灌胃给药联合紫杉醇(12 mg/kg)每周注射1次的肿瘤抑制率(62.01%)较紫杉醇、HBBR单药分别提高18.54%、15.06%;同时在Lewis肺癌荷瘤模型中,该组合的肿瘤抑制率(57.99%)较紫杉醇、HBBR单药分别提高19.94%、21.66%,由此可见HBBR与紫杉醇联合给药有利于各自药效的提高。结论:本研究通过分析非小细胞肺癌相关芯片数据,首次在多个数据集中挖掘出了一系列共有表达的差异基因,通过网络数据库及工具对差异基因进行分析后,发现NSCLC的发生与细胞周期、增殖、凋亡相关蛋白的异常表达关系极为密切。通过体内及体外实验,首次证实小檗碱的C8位十六烷基取代物即HBBR具有抗肺癌活性且其抑制肿瘤活性与细胞周期及凋亡密切相关。通过分析HBBR给药后荷瘤裸鼠的肠道微生物菌群,发现HBBR治疗有利于维持荷瘤小鼠体内健康的肠道微生物环境。并且通过分析HBBR与紫杉醇单用及联合给药对荷瘤裸鼠模型以及Lewis肺癌细胞荷瘤小鼠模型皮下瘤组织生长的影响,发现HBBR联合紫衫醇给药有利于进一步提高单药药效。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

版本,软件

图 1-1 R 软件（3.4.0 版本）截图Fig.1-1. The operation interface of R software (version 3.4.0).

版本,软件,功能注释,异基因

图 1-2 FuRich 软件（2.1.2 版本）截图Fig.1-2. The operation interface of FuRich software (version 2.1.2).异基因分析及功能注释了进一步研究非小细胞肺癌与正常组织之间差异基因的功能，我们使用

版本,网络构建,非小细胞肺癌,异同

图 1-3 DAVID（6.8 版本）截图Fig.1-3. The operation interface of online database DAVID (version 6.8). 蛋白相互作用网络构建为研究非小细胞肺癌相对正常组织所发生的分子机理异同，我们通过 ST

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