达玛烷类天然产物激活MM型肌酸激酶的构效关系研究
发布时间：2020-07-23 00:19
【摘要】：目的前期通过亲和“垂钓”、凝胶电泳和蛋白质质谱鉴定,发现肌肉型肌酸激酶(CK-MM)是人参皂苷在骨骼肌组织内的作用靶点。课题组以20(S)-原人参二醇[20(S)-PPD]为代表,采用生物膜层干涉技术(BLI)和等温滴定量热技术(ITC)确证了20(S)-PPD与CK-MM之间的直接相互作用。此外,体内外实验发现20(S)-PPD可以通过别构调节的方式激活CK-MM的活性,增加骨骼肌组织中磷酸肌酸(PCr)的含量,增强骨骼肌CK/PCr系统的功能,从而可有效延缓运动训练诱导的乳酸堆积,发挥抗疲劳的效应。然而,20(S)-PPD激活CK-MM活性的程度并不理想,体外对鼠源性和人源性CK-MM活性的最大提高幅度约10%。众所周知,20(S)-PPD属于达玛烷类天然产物。本学位论文试图探讨达玛烷类天然产物激活CK-MM的构效关系,为从天然产物中或采用结构修饰的方式寻找更好的CK-MM激活剂提供前期支撑。方法实验1:酸枣仁苷元(Jujubogenin)与24-羧基-原人参二醇(24-COOH-PPD)的制备先用大孔吸附树脂D101联合阴阳离子交换树脂D201及D113,制备高纯度酸枣仁总皂苷,再根据报道的文献,用氧化切割法制备粗Juj ubogenin,最后用硅胶柱层析、甲醇重结晶制备高纯度Juj ubogenin,用薄层色谱和HPLC分析纯度;根据公开的专利,采用高锰酸钾氧化方法制备粗24-COOH-PPD,再用硅胶柱层析得到高纯度的24-COOH-PPD,用薄层色谱和HPLC分析纯度。实验2:达玛烷类天然产物体外对CK-MM活性的影响将12个不同浓度的达玛烷类化合物,包括人参皂苷Rgl、Rd和Rh以及达玛烷类苷元20(S)-PPD、20(R)-PPD、20(S)-原人参三醇[20(S)-PPT]、人参二醇(PD)、人参三醇(PT)、奥克梯隆(Ocotillol)、25-羟基-原人参二醇(25-OH-PPD)、Jujubogenin和24-COOH-PPD与CK-MM结合后,通过CK测定试剂盒来检测它们对CK-MM活性的影响。实验3:达玛烷类天然产物与CK-MM直接相互作用利用BLI技术测定上述12个达玛烷类化合物与CK-MM的直接相互作用强度。实验4:20(S)-PPD与CK-MM的分子对接利用Schrodinger软件对CK-MM和20(S)-PPD进行仿真对接,再用GlideScore工具对20(S)-PPD在每个潜在结合位点的对接形态进行评分,分析20(S)-PPD与CK-MM的结合位点和结合模式。实验5:突变型与人源型CK-MM的制备采用定点突变技术,以pET10为模板,构建了pET11、pET12和pET13质粒,再将质粒转化大肠杆菌BL-21细胞,表达带His标签的CK-MM。最后用HisTrapTM HP柱来纯化蛋白,用SDS-PAGE在10%聚丙烯酰胺凝胶上评估蛋白纯度。实验6:20(S)-PPD与野生型和突变型(Mutant)人源CK-MM亲和力的测定采用ForteBio Octet RED96系统检测20(S)-PPD与野生型或三种突变型人源CK-MM的结合情况。利用ForteBio Data Analysis软件来分析数据,获得结合常数(Kon)及解离常数(Kdis),根据公式KD=Kdis/Kon计算出亲和力数值(KD)。结果实验1:利用大孔树脂吸附法获得10 g高纯度酸枣仁粗皂苷,再通过氧化切割制备出2 g粗Jujubogenin,经硅胶柱反复层析获得100 mg Jujubogenin,其纯度为90.7%;利用高锰酸钾氧化法制备出150 mg的粗24-COOH-PPD,经硅胶柱层析得到30 mg精制的24-COOH-PPD,其纯度为90.2%。实验2:(1)达玛烷类苷元对CK-MM酶活的影响。20(S)-PPD、20(R)-PPD、20(S)-PPT、24-COOH-PPD、25-OH-PPD及PD与兔源CK-MM结合后能够提高其酶活,最大激活程度由大到小:20(S)-PPD24-COOH-PPD20(S)-PPT20(R)-PPD25-OH-PPDPD;PT和Ocotillol对兔源CK-MM的活性无明显影响;Jujubogenin与酶结合后反而抑制其活性。(2)人参皂苷及其苷元对CK-MM酶活的影响。20(S)-PPD、20(S)-PPT和Rh2能够提高鼠源CK-MM的活性,最大激活程度由大到小:20(S)-PPD20(S)-PPTRh2;Rd和Rg1与CK-MM结合后,其酶活无明显改变。实验3:(1)达玛烷类苷元与CK-MM的直接相互作用。在20 μM浓度下,Ocotillol、PT和Juj ubogenin与His标签的CK-MM直接相互作用较弱,而20(S)-PPD、20(R)-PPD、20(S)-PPT、PD、25-OH-PPD及24-COOH-PPD与CK-MM的直接相互作用较明显。24-COOH-PPD相互作用强度由大到小:20(S)-PPD24-COOH-PPD20(S)-PPPT20(R)-PPD25-OH-PPDPDOcotillolPTJujubogenin。(2)人参皂苷及其苷元与CK-MM的直接相互作用。在20 μM浓度下,Rg1和Rd几乎与生物素化的CK-MM没有直接的相互作用。随着极性和糖分子的减少,Rh2及其苷元[20(S)-PPD和20(S)-PPT]逐渐与CK-MM有直接的相互作用。相互作用程度由大到小:20(S)-PPD20(S)-PPTRh2RglRd。实验4:FTMap和SiteMap软件分析发现人源CK-MM晶体结构表明上有两个活性结合位点,除了激酶均具备的ADP结合位点(Sl")外,还有一个临近位点(S2")。20(S)-PPD对接到S2"位点的构象评分大于与ADP结合口袋(S1")的对接评分。20(S)-PPD可通过2个负电性基团(3-OH和12-OH)生成3个氢键与S2"位点的氨基酸残基(Q318、R320和S285)相互作用。实验5:基于分子对接预测到的位点关键氨基酸(Q318,R320及S285),利用基因定点诱变和蛋白纯化技术,制备出三个突变型人源CK-MM:突变体1(Q318P,318位点的谷氨酰胺突变为脯氨酸)、突变体2(R320T,320位的精氨酸突变为苏氨酸)和突变体3(S285T,285位的丝氨酸突变为苏氨酸)。实验6:野生型、突变体1、突变体2和突变体3与20(S)-PPD的KD值分别为2.3 7±0.11E-5M,3.09±0.11E-2 M,5.14±0.13E-4M和9.56±0.10E-5M。野生型与20(S)-PPD结合后的亲和力分别是突变体1、突变体2和突变体3与20(S)-PPD结合亲和力的1300、20和4倍。S2"位点关键氨基酸(R320和S285)的突变均降低了20(S)-PPD与CK-MM的亲和力,Q318位点突变几乎导致20(S)-PPD与CK-MM结合能力的丧失。结论1.达玛烷类天然产物母核C-3、C-6以及C-20位置连接了糖分子后会弱化其激活CK-MM的能力以及和CK-MM的相互作用。2.与天然S型构象相比,R型构象会降低其与CK-MM的直接相互作用。3.达玛烷类苷元侧链上形成环状结构以及母核上C-6位置的取代基团会明显影响到其与CK-MM的结合以及激活CK-MM的能力。4.达玛烷类天然产物母核上的3-OH和12-OH是其与CK-MM直接相互作用的重要化学基团,并且3-OH的重要性要高于12-OH。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：
４．１邋Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ邋的制备逡逑对酸枣仁粗苷元采用硅胶薄层进行展开（石油醚：乙酸乙酯＝１：１）邋，邋１０％硫酸乙醇，逡逑１０５邋°Ｃ供干显色结果见图４－２，可见呈蓝色斑点的Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ；然后，对酸寒仁粗昔元进行逡逑硅胶柱层析分离，共收集了邋５１管洗脱液（８ｍｌ／管），硅胶薄层展开（石油醚：乙酸乙酯＝逡逑１：１）邋，邋１０邋％硫酸乙醇，１０５邋°Ｃ烘干显色结果见图４－３和图４－４，合并３３－４３洗脱液；最后，逡逑减压回收洗脱剂，残渣经甲醇重结晶后，硅胶薄层展开（石油醚：乙酸乙酯＝２：１），１０％逡逑硫酸乙醇，１０５邋°Ｃ烘干显色结果见图４－５。精制的Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ液相色谱图见图４－６，面积逡逑归一化法计算的纯度约为９０．７％。逡逑Y"逦ｍ：逦想邋＿逦ｍ－R猓洌椋椋义贤迹矗菜嵩嫒蚀周赵〔闵淄煎义希叔义希慑义希慑义贤迹矗乘嵩嫒蚀周赵阄鱿赐岩罕〔闵淄迹ǎ保常罚╁义希常村义
本文编号：2766576
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：
４．１邋Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ邋的制备逡逑对酸枣仁粗苷元采用硅胶薄层进行展开（石油醚：乙酸乙酯＝１：１）邋，邋１０％硫酸乙醇，逡逑１０５邋°Ｃ供干显色结果见图４－２，可见呈蓝色斑点的Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ；然后，对酸寒仁粗昔元进行逡逑硅胶柱层析分离，共收集了邋５１管洗脱液（８ｍｌ／管），硅胶薄层展开（石油醚：乙酸乙酯＝逡逑１：１）邋，邋１０邋％硫酸乙醇，１０５邋°Ｃ烘干显色结果见图４－３和图４－４，合并３３－４３洗脱液；最后，逡逑减压回收洗脱剂，残渣经甲醇重结晶后，硅胶薄层展开（石油醚：乙酸乙酯＝２：１），１０％逡逑硫酸乙醇，１０５邋°Ｃ烘干显色结果见图４－５。精制的Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ液相色谱图见图４－６，面积逡逑归一化法计算的纯度约为９０．７％。逡逑Y"逦ｍ：逦想邋＿逦ｍ－R猓洌椋椋义贤迹矗菜嵩嫒蚀周赵〔闵淄煎义希叔义希慑义希慑义贤迹矗乘嵩嫒蚀周赵阄鱿赐岩罕〔闵淄迹ǎ保常罚╁义希常村义
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