南天竹籽总生物碱对三氧化二砷减毒作用研究

发布时间：2020-07-23 00:27

【摘要】：三氧化二砷(As_2O_3)是传统中药砒霜中的主要成分,现代药理学和分子生物学证明了As_2O_3治疗肿瘤的有效性并具有广谱抗癌作用,尤其在治疗急性早幼粒细胞性白血病更是取得满意的疗效。而As_2O_3属剧毒药,在临床上治疗安全窗口较小,在应用中会产生较多不良反应,毒副作用大大限制了其临床应用。文献及前期研究显示:南天竹提取物对抗肿瘤药三氧化二砷具有减毒持效作用,南天竹中生物碱类成分为主要减毒活性成分,单一生物碱减毒作用均不及总生物碱部位,提示南天竹生物碱类成分对三氧化砷减毒具有明显的多靶点、多途经的中医药特点。然而,南天竹籽总生物碱部位分离纯化工艺有待优选、南天竹籽总生物碱类部位化学成分有待进一步阐明。据此,开展了南天竹籽总生物碱对As_2O_3减毒作用相关研究。本课题分为四个部分,具体研究内容如下:1.南天竹籽总生物碱提取纯化工艺研究本实验以小檗碱作为对照品,采用酸性染料比色,得到南天竹籽中总生物碱的最佳提取工艺条件为8倍量75%的乙醇回流提取3次,每次1 h。HPD-722型树脂具有最佳的吸附及洗脱参数,其最佳纯化条件为:上样液总生物碱质量浓度为4 mg·mL~(-1),上样量35 mL,上样流速2 mL·min~(-1),先以6 BV体积的水洗去杂质,再以10 BV体积的80%乙醇以1 mL·min~(-1)的流速洗脱,得总生物碱含量达到70%以上。2.总生物碱部位对三氧化二砷减毒作用研究通过生化指标及组织形态学检测两个方面,研究提取纯化所得的南天竹籽总生物碱部位对三氧化二砷减毒作用。生化指标检测显示,单独给药组的CK、AST、LDH、尿素氮、MDA、ALT明显高于联合给药组和空白组,单独给药组的Na~+-K~+-ATP酶、SOD、CAT、肌酐消除率明显低于联合给药组和空白组。组织形态学检测显示,小鼠三氧化二砷单独用药组部分出现心脏细胞水肿情况,联合用药组心脏均显示正常;大鼠三氧化二砷单独用药组心组织及细胞未见损伤,部分出现肾小球变小,肝组织中广泛出现肝细胞水肿、点状坏死,典型肝血窦扩张,嗜酸性变性,脂肪变性等损伤,而联合用药组心和肾组织及细胞未见损伤,仅少部分肝细胞出现水肿,有少量炎性细胞浸润。结合生化指标及组织形态学检测,表明提取纯化的总生物碱部位对三氧化二砷具有较明显减毒作用。3.南天竹籽总生物碱部位的化学分离与鉴定采用柱色谱技术对南天竹籽总生物碱部分进行分离纯化,共分离鉴定得到15个化合物,其中11个生物碱类成分,4个其他类成分,包括:N-Methyl-3-phenyl-N-(2S,3R,4-trihydroxy-butyl)-acrylamide(1)、N-Methyl-3-phenyl-N-(2R,3R,4-trihydroxy-butyl)-acrylamide(2)、O-甲基南天竹碱(3)、N-去甲基南天竹碱(4)、Hydroxynantenine(5)、南天宁碱(6 nantenine)、巴马亭(7 palmatine)、O-甲基球紫堇碱(8 O-methylbulbocapnine)、海罂粟碱(9 glaucine)、去二氢海罂粟碱(10 didehydroglaucine)、5-羟基-2-吡啶羧酸甲酯(11)、Amentoflavone(12)、异落叶松脂素(13)、原儿茶醛(14)、3,4-二羟基苯乙酮(15)。其中化合物1、2为新化合物,化合物5,11,12,13,14,15为首次从该植物分离得到。4.南天竹籽总生物碱定性与南天宁碱定量分析采用Peakview(Version1.2,AB SCIEX)软件对南天竹籽质谱数据进行处理,依据相对分子量测定值与精确相对分子质量的理论值偏差小于10.0×10~(-6)的原则,基于高分辨质谱的精确分子量信息,共鉴别25个生物碱,其中已知生物碱18个,未知化合物7个。采用薄层色谱鉴别,在同一薄层板上南天竹果实总生物碱溶液与新化合物N-Methyl-3-phenyl-N-(2,3,4-trihydroxy-butyl)-acrylamide在相同位置上,显示相同的斑点。采用高效液相色谱仪,考察南天竹籽中标志性生物碱成分——南天宁碱在总生物碱中的含量,得其含量为0.227 mg/mg。
【学位授予单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

长扫描,显色剂,全波,色剂

图 1 两种显色剂全波长扫描o-color developer full-wavelength 2 mL 对照品溶液，在测试波长处色剂吸光度的大小，测定结果见表色剂测得吸光度值相对较大，因此表 1 酸性染料选择试验数据Table 1 Acid dye selection test da溴甲酚绿 0.984 取 2 mL 对照品溶液，分别置于溶液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，溶解，摇匀静置30 min，加入氯仿5

标准曲线,盐酸小檗碱,标准曲线,线性关系

得出标准曲线为 y=0.0161x-0.0279，r=0.9992，在 10.24小檗碱的线性关系良好。试验精密吸取样品溶液 2 mL，显色后，测定吸光度。得出其精密度 RSD=0.144%，证明仪器精密度良好。结表 6 精密度试验数据Table 6 Precision test data2 3 4 5 6 平均68 0.567 0.568 0.567 0.569 0.567 0.567试验分别精密吸取样品溶液 2 mL，制备 6 份供试品溶。由数据 RSD=2.66% 可得，其仪器重复性良好。结果表 7 重复性试验数据Table 7 Repeatability test data1 2 3 4 5 6 平均

洗脱,动态,样液,浓度

得出浓度 4 mg/mL 为最佳上样液浓度。见表 20。表 20 上样液浓度结果Table 20 Sample concentration results浓度（mg/mL） 8 4 2吸附率（%） 97.64 97.40 97.40洗脱率（%） 46.00 63.13 53.11纯度（%） 44.9 61.5 51.7最大上样量准确称取处理好的树脂 30 g(湿重)，取浓度为 4 mg/mL 的上样液，以 0.5 mL/min 的流速加入树脂中，用容器收集流出液，每 10 mL 一管，测定收集液中的总生物碱的含量，绘制关于吸附的动态曲线。结果显示，当上样量的体积在 20 mL 左右的时候，生物碱类物质开始泄露增加，为减少损失，提高回收率，本实验选用最大上样量为 35 mL。结果见图 3。

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