涤痰汤干预血管性痴呆大鼠炎症反应及兴奋性氨基酸毒性作用的研究

发布时间：2020-07-23 01:44

【摘要】：目的血管性痴呆(Vascular Dementia,VD)是严重影响老年人群健康的重大疑难疾病,也是目前唯一可以预防并具有一定可逆性的痴呆。由于目前的治疗手段和治疗药物对改善患者认知障碍的疗效有限,因此,如何有效地控制该病的发展是当前急需解决的一个医学和社会问题。中医学认为“治呆不治痰非其治也”,针对痴呆的治疗,现代中医在前人经验的基础上也视“从痰论治”为治疗方案之一。本课题组的前期研究显示,涤痰汤能够改善老年轻度认知障碍大鼠的学习与记忆能力,但对血管性痴呆的治疗作用尚未明确;另外,文献调研表明,机体炎症反应和兴奋性氨基酸的毒性作用是导致血管性痴呆的发病机制,而该机制与中医学的痰浊阻窍致病密切相关。因此,本文以血管性痴呆模型大鼠为研究对象,以涤痰汤为治疗方法,针对涤痰汤对模型大鼠炎症反应及兴奋性氨基酸毒性作用的干预机制,展开理论与实验研究,旨在探索VD发生发展过程中“痰浊阻窍”病机的分子生物学基础,明确涤痰汤对VD的治疗作用及作用机制。方法本研究所采用的方法包括理论研究和实验研究。理论研究表明,血管性痴呆的发病原因之一是炎症因子和兴奋性氨基酸的表达增多;调控NMDA受体介导的兴奋性氨基酸毒性作用和NF-κB介导的炎症反应可作为血管性痴呆治疗的一个方案和实验设计的一个出发点。因此,本文设计了以下以SPF级雄性SD大鼠为研究对象的实验研究方案:1、SPF级雄性SD大鼠随机分为6组,即空白组、模型组、涤痰汤高剂量组(以下简称“涤高组”)、涤痰汤中剂量组(以下简称“涤中组”)、涤痰汤低剂量组(以下简称“涤低组”)及西药组,每组12只。2、空白组大鼠以普通饲料喂养,其余5组大鼠均以高脂饮食喂养。喂养8周后进行造模,以改良2-血管阻断法构建血管性痴呆大鼠模型。3、大鼠造模成功后灌胃给药,按照人与大鼠体表面积系数比确定给药量。涤痰汤高、中、低剂量组给药量分别为涤痰汤折合生药量20 g·kg~(-1)、10 g·kg~(-1)、5 g·kg~(-1)体重,西药组给药量为盐酸美金刚2 mg·kg~(-1)体重,空白组、模型组按照10 ml·kg~(-1)给予等容积生理盐水灌胃。每日给药1次,连续进行4周。4、采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力;光镜下观察大鼠海马组织形态学变化;ELISA法检测大鼠血清中血脂(包括TC、TG、HDL、LDL)及Hcy浓度;Realtime PCR法检测大鼠海马CA1区炎症相关指标NF-κB、MMP-9、TNF-αmRNA表达量;ELISA法检测大鼠血清炎症相关指标NF-κB、MMP-9、TNF-α含量变化;ELISA法检测大鼠海马CA1区细胞凋亡因子P53、Bax、Bcl-2含量变化;以化学比色法检测大鼠海马CA1区Glu的浓度变化,Realtime PCR法、免疫组织化学法检测大鼠海马CA1区NMDAR亚基NR1、NR2A、NR2B的表达及分布情况。结果1、大鼠Morris水迷宫实验检测结果:(1)定位航行实验:在训练第5d,与空白组相比,模型组的逃避潜伏期明显延长(P0.01);与模型组相比,涤痰汤各组及西药组的逃避潜伏期均有所缩短(P0.05)。(2)空间探索实验:与空白组相比,模型组的穿越平台次数明显减少(P0.01),目标象限时间明显缩短(P0.01);与模型组相比,涤痰汤各组及西药组的穿越平台次数明显增加(P0.01),目标象限时间明显延长(P0.01)。2、光镜下观察大鼠海马CA1区组织形态学变化结果:HE染色结果显示,模型组大鼠海马CA1区椎体细胞形态结构不完整、排列紊乱,细胞胞体缩小、胞浆浑浊、核仁固缩,正常细胞数量明显减少;涤痰汤各组及西药组与模型组相比,椎体细胞形态规则,排列整齐,正常细胞数量增多;细胞结构完整,核及核仁清晰可见,细胞质丰富,核固缩变性现象有所好转。3、大鼠血脂情况检测结果:与空白组比较,模型组大鼠的TG、TC和LDL明显升高(P0.01),HDL明显降低(P0.01)。与模型组比较,涤痰汤各组大鼠的TG、TC和LDL均降低(P0.05),HDL均升高(P0.05);西药组的血脂情况无明显改变(P0.05)。4、大鼠Hcy浓度检测结果:模型组大鼠的血清Hcy浓度均明显高于空白组(P0.01);涤痰汤各组大鼠的血清Hcy浓度均明显低于模型组(P0.01)。5、大鼠炎症因子及细胞凋亡因子检测结果:(1)RT-PCR法结果显示,大鼠海马CA1区,与空白组相比,模型组NF-κB mRNA、MMP-9、TNF-αmRNA表达均明显增多(P0.01);与模型组相比,涤痰汤各组及西药组NF-κB mRNA、MMP-9、TNF-αmRNA表达均明显降低(P0.05);涤痰汤各组NF-κB mRNA、MMP-9、TNF-αmRNA表达均低于西药组(P0.05)。(2)ELISA法结果显示,大鼠血清中,模型组NF-κB、MMP-9、TNF-α浓度均明显高于空白组(P0.01);与模型组相比,涤痰汤各组NF-κB、MMP-9、TNF-α浓度均显著降低(P0.01);与西药组相比,涤高组、涤中组NF-κB浓度显著降低(P0.01),涤高组、涤中组MMP-9、TNF-α浓度亦有所降低(P0.05)。大鼠海马中,模型组大鼠P53、Bax的浓度高于空白组(P0.05),Bcl-2的表达低于空白组(P0.05);与模型组相比,涤痰汤各组及西药组P53、Bax的浓度均显著降低(P0.05),Bcl-2的含量均升高(P0.05);与西药组相比,涤痰汤各组P53浓度、涤中组Bax浓度均有所降低(P0.05),涤痰汤各组Bcl-2的含量均升高(P0.05)。6、大鼠海马CA1区Glu浓度、NMDA受体亚基表达及分布情况检测结果:(1)RT-PCR法检测NMDA受体mRNA的基因水平,结果显示,模型组NMDAR亚基NR1、NR2A、NR2B mRNA表达均明显高于空白组(P0.01);与模型组相比,涤痰汤各组及西药组的NMDAR亚基NR1、NR2A、NR2B mRNA表达均降低(P0.05);其中涤高组的NR2B mRNA表达较西药组更低(P0.05)。(2)免疫组化法检测NMDA受体亚基NR1、NR2A、NR2B的阳性表达和分布情况,结果显示,在各组大鼠的海马CA1区中,NR1、NR2A、NR2B在模型组的阳性表达明显多于空白组、涤痰汤各组及西药组,且阳性细胞的染色更深,呈深棕色;涤痰汤各组及西药组的NR1、NR2A、NR2B阳性细胞表达均少于模型组,染色呈较浅的棕黄色,其中涤高组的NR1表达方式与空白组相似。(3)Glu浓度的检测结果显示,模型组Glu浓度明显高于空白组(P0.01);涤痰汤各组及西药组Glu浓度均低于模型组(P0.05);与西药组相比,涤痰汤各组Glu浓度亦显著降(P0.01)。结论1、模型大鼠的学习记忆能力和空间探索能力明显降低,海马组织的病理改变典型,是成功的血管性痴呆动物模型。2、涤痰汤具有调节机体的血脂和血同型半胱氨酸水平的功能,从而起到保护VD大鼠模型的学习记忆能力的作用,是涤痰汤减轻血管性痴呆发病风险的一个可能机制。3、涤痰汤能够抑制NF-κB/MMP-9信号通路,促进Bcl-2的表达和减少NF-κB、MMP-9、TNF-α、P53、Bax的表达,以此保护血脑屏障的完整性,减轻炎症反应对中枢神经系统的损伤,减少细胞凋亡,使机体的认知功能水平得到改善。4、涤痰汤可以通过降低VD大鼠模型海马区NMDA受体及Glu的表达量,和减轻兴奋性氨基酸的毒性作用,达到保护海马神经元和改善VD大鼠认知功能障碍的目的。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

空间探索,中医药大学,西药,博士学位论文

湖北中医药大学 2019 届博士学位论文组 10.81±2.582)3)47.43±6.452)5)组 11.02±2.132)3)49.10±4.822)5)组 7.99±1.342)4)35.72±7.112)4)组 8.29±2.072)36.85±6.462)与空白组比较，1) P<0.01；与模型组比较，2) P<0.01；与西药组比较，3) P<0.05，4) P><0.01

扩增曲线,数据差异,单因素方差分析,炎症反应

涤痰汤干预血管性痴呆大鼠炎症反应及兴奋性氨基酸毒性作用的研究所得数据以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS19.0 进行统计分析。组间数据的比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），以分析所得 P 值小于 0.05（P<0.05）表示比较的数据差异显著，具有统计学意义。2.3.3 结果(1) 各组大鼠海马 CA1 区 NF-κB、MMP-9、TNF-α mRNA 的 Realtime PCR结果

扩增曲线

(1) 各组大鼠海马 CA1 区 NF-κB、MMP-9、TNF-α mRNA 的 Realtime PCR结果图 4 NF-κB 扩增曲线Fig. 4Amplification curve of NF-κB

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