MJS对TRP通道调节作用的研究

发布时间：2020-07-23 23:13

【摘要】：目的:在C57BL/6小鼠原代培养背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元细胞研究MJS对组胺(Histamine,Hist)、血清素(5-hydroxytryptamine,5-HT)、内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)及氯喹(Chloroquine,Chlo)的抑制作用;在DRG神经元细胞研究MJS对TRP通道的调节作用;在质粒转染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白的HEK293T细胞研究MJS对TRP通道的调节作用。方法及结果:1.MJS在原代培养DRG神经元对Hist、5-HT、ET-1及Chlo的抑制作用快速分离、收集4-6周C57BL/6雄性小鼠L2-L6(Lumbar two-Lumbar six)DRG,培养16-18 h,在钙成像系统(RC-26型放大器、MP-285型1550B数模转换器、BT100-2J型显微镜及DG-4型离子成像光源),采用荧光探针Fura-2-A研究MJS对Hist、5-HT、ET-1及Chlo的抑制作用。Fura-2-AM胞内钙离子浓度检测结果显示,20μM MJS对DRG神经元细胞胞内钙离子浓度无明显影响;100μM Hist、100μM 5-HT、100μM ET-1及100μM Chlo均可引起钙离子浓度显著升高;20μM MJS可明显抑制100μM Hist、100μM5-HT、100μM ET-1及100μM Chlo所致钙离子浓度的升高。2.不同TRP通道特异激动剂对原代培养DRG神经元钙离子浓度的影响及MJS的调节作用取分离、培养的DRG神经元细胞,采用Fura-2-AM检测胞内钙离子浓度,研究TRPV1特异激动剂辣椒素(Capsaicin,Cap)、TRPV4特异激动剂GSK1016790A(GSK101)及TRPA1特异激动剂AITC对钙离子浓度的影响及MJS的调节作用。Fura-2-AM钙成像结果显示,20μM MJS对DRG神经元细胞中钙离子浓度无明显影响;1μM Cap、100 n M GSK101及100μM AITC均可引起钙离子浓度显著升高;20μM MJS可明显抑制100 n M Cap和50 n M GSK101所致钙离子浓度的升高;而对100μM AITC所致钙离子浓度升高无明显影响。3.不同TRP通道特异激动剂对质粒转染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白HEK293T细胞钙离子浓度的影响及MJS的调节作用采用DMEM高糖培养基培养HEK293T细胞,分别转染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白,转染试剂采用LIPOFECTAMINE 2000。以质粒中RFP红色蛋白为报告基因,转染48 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的红色荧光细胞,计算转染率;采用免疫印迹法(Western blotting,WB)和实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,Q-PCR)法检测转染结果。采用Fura-2-AM观察Cap、GSK101及AITC对质粒转染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白的HEK293T细胞钙离子浓度的影响及MJS的调节作用。转染TRP蛋白N端融合Red fluorescent protein(RFP)红色荧光蛋白,荧光结果可见红色荧光蛋白在HEK293T细胞中的表达,表明重组质粒成功转入宿主细胞并表达,转染率为60%以上;WB和Q-PCR结果分别检测到阳性蛋白和m RNA的表达,说明质粒转染TRP蛋白到HEK293T细胞成功并表达。Fura-2-AM钙成像结果显示,20μM MJS对质粒转染TRPV1、TRPV4及TRPA1蛋白的HEK293T细胞钙离子浓度无明显影响;100 n M Cap、50 n M GSK101及100μM AITC均可导致相应质粒转染的HEK293T细胞钙离子浓度显著升高;20μM MJS可显著抑制100 n M Cap和50 n M GSK101所致质粒转染TRPV1、TRPV4蛋白的HEK293T细胞钙离子浓度的升高,对100μM AITC引起钙离子浓度的升高无明显影响。结论:MJS在原代培养DRG神经元对Hist、5-HT、ET-1和Chlo引起的兴奋作用有显著抑制;TRPV1、TRPV4及TRPA1通道参与DRG神经元及质粒转染TRP蛋白的HEK293T细胞的兴奋性,MJS能够抑制TRPV1及TRPV4通道的激活,对TRPA1通道激活无影响。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

ANOVA）方差分析，结果均用 mean ± SEM 表示。P<0.05 表示差异具有统计学意义。4.实验结果4.1 C57BL/6 小鼠原代培养 DRG 神经元细胞的形态学特点及细胞鉴定刚接种的细胞为圆形或者椭圆形，约 3 h 开始贴壁（A），接种 12 h 后大多数细胞开始贴壁，有的已经长出突起，2 天之后神经元突起生长迅速，形成树突网（B）。7 天之后神经元突起多而粗大，细胞形态饱满，胞体呈现圆形或者椭圆形，胞体比较大，光晕强，细胞之间交织形成密集神经元网络、且突起细长。细胞采用 NSE 免疫组化鉴定，NSE 在胞浆中表达，染色后阳性细胞呈深棕色，形态为圆形或者椭圆形，有的细胞可显示突起伸出（C）。A B CA B C

A) Culture the cells for 1 hour（.光镜×200）(B) Culture the cells for 24 hour（.(C) Expression of NSE protein in DRG neurons.（DAB×200）ist和 5-HT对原代培养DRG神经元细胞钙离子浓度影响及MJS的用 Fura-2AM 钙成像技术，分别检测 Hist 和 5-HT 在原代培养的钙离子浓度的变化，并研究 MJS 的调节作用。果如图 2 所示，100 μM Hist 可致 DRG 神经元细胞钙离子浓度；20 μM MJS 对 DRG 细胞中钙离子浓度无明显影响（A）；抑制 100 μM Hist 所致钙离子浓度的明显升高（A），差异具有）（B）。00 μM 5-HT 可致 DRG 神经元细胞钙离子浓度明显升高（C）；G 细胞中钙离子浓度无明显影响（C）；20 μM MJS 可明显抑制 10离子浓度的明显升高（C），差异具有显著性（P < 0.05）（D

安徽医科大学硕士学位论文结果如图 3 所示，100 μM ET-1 可致 DRG 神经元细胞钙离子浓度明显升高（A）；20 μM MJS 对 DRG 细胞中钙离子浓度无明显影响（A）；20 μM MJ可明显抑制 100 μM ET-1 所致钙离子浓度的明显升高（A），差异具有显著性（< 0.05）（B）。100 μM Chlo 可致 DRG 神经元细胞钙离子浓度明显升高（C）；20 μM MJ对 DRG 细胞中钙离子浓度无明显影响（C）；20 μM MJS 可明显抑制 100 μM Chl所致钙离子浓度的明显升高（C），差异具有显著性（P < 0.05）（D）。

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本文编号：2767965