灵芝三萜B8组分在体内外逆转由ABCB1介导的肿瘤多药耐药作用及其机制研究

发布时间：2020-07-23 22:48

【摘要】：背景及目的:化学疗法是临床肿瘤患者常用的治疗手段,治疗过程中产生的原发和继发耐药是肿瘤化疗失败的根本原因,克服耐药是提高肿瘤化疗效果的关键。据美国临床肿瘤学会(ASCO)统计,90%以上肿瘤患者死亡原因与肿瘤多药耐药(MDR)有关,其中ATP结合盒(ATP binding casssette,ABC)转运蛋白的过表达是引起MDR的主要原因。目前为止,还没有耐药逆转剂被美批准上市,从传统中药中寻找高效、低毒、专一性好的耐药逆转剂是研究者关注的热点之一。灵芝三萜B8组分是从灵芝中提取分离出来的活性物质,课题组发现B8在低剂量下有着良好的逆转MDR耐药活性。本文主要评价灵芝三萜B8组分在体内外逆转由ABCB1介导的多药耐药活性作用及其机制研究。方法:(1)用MTT法测定非细胞毒浓度的灵芝三萜B8组分作用于ABCB1高表达的耐药细胞株及对应的敏感细胞株对其底物药物和非底物药物的耐药逆转活性;(2)用RT-qPCR、Western Blot法分别检测灵芝三萜B8组分对ABCB1基因的mRNA、P-gp蛋白表达数量变化影响;(3)通过流式细胞仪观察灵芝三萜B8组分对罗丹明123、多柔比星的蓄积以及对多柔比星外排影响;(4)采用Pgp-Glo~TMM ATPase试剂盒体外检测灵芝三萜B8组分对ABCB1 ATP酶活性的影响;(5)使用P450-Glo~TMM Screening System试剂盒体外检测灵芝三萜B8组分对肿瘤药物代谢肝药酶CYP3A4活性的影响;(6)通过建立ICR小鼠肝癌H_(22)皮下移植瘤模型,观察灵芝三萜B8组分对口服紫杉醇抗肿瘤作用的影响,探讨灵芝三萜B8组分对肠黏膜P-糖蛋白转运体的影响;(7)通过建立裸鼠KBv200皮下移植瘤模型,观察灵芝三萜B8组分联合长春新碱对KBv200皮下移植瘤的抑制作用,探讨灵芝三萜B8组分体内逆转耐药的作用;(8)采用HPLC法观察灵芝三萜B8组分处理组对抗癌药物紫杉醇药物代谢动力学的影响作用。结果:(1)灵芝三萜B8组分作用于各高表达P-gp耐药株相对于各亲本细胞株的毒性较为不敏感;(2)非细胞毒浓度的灵芝三萜B8组分作用于高表达P-gp细胞株对于P-gp底物药物多柔比星、紫杉醇、长春新碱有着逆转耐药的效果,并随着灵芝三萜B8组分的剂量提高逆转倍数也随之增加,然而对非P-gp底物药物顺铂则无逆转耐药效果,同时对亲本细胞株几乎无增效作用;(3)灵芝三萜B8组分能显著性增加对P-gp底物罗丹明123以及多柔比星的蓄积量;同时对多柔比星的外排功能起到抑制作用;(4)灵芝三萜B8组分对ABCB1基因mRNA、P-gp的表达数量上无差异变化;(5)灵芝三萜B8组分对肿瘤药物代谢肝药酶CYP3A4活性的抑制影响呈药物梯度依赖性,灵芝三萜B8组分低浓度(2μg/mL)对代谢肝药酶CYP3A4活性抑制程度较弱;(6)灵芝三萜B8组分对ABCB1 ATPase活性无显著影响;(7)灵芝三萜B8组分可能通过抑制胃肠道黏膜P-gp转运体的功能,有效增强口服紫杉醇对小鼠皮下H_(22)移植瘤的抗肿瘤作用;(8)长春新碱(VCR)(0.5mg/kg)、B8(200mg/kg)、B8+VCR(200+0.5mg/kg)组对裸鼠KBv200皮下移植瘤的抑瘤率分别为23.12%、31.87%、59.85%。(9)通过口服灵芝三萜B8组分处理组与阴性组的比较,两组的小鼠紫杉醇药代动力学参数并无显著性差异。结论:灵芝三萜B8组分在体内外能够有效地逆转由ABCB1介导的耐药作用。主要通过以下机制研究:(1)灵芝三萜B8组分抑制P-gp转运体的功能;(2)灵芝三萜B8组分并不改变对P-gp转运体的表达;(3)灵芝三萜B8组分低浓度(2μg/mL)对代谢肝药酶CYP3A4活性抑制作用较弱;(4)灵芝三萜B8组分对ABCB1 ATPase活性无影响变化;(5)灵芝三萜B8组分能够可能通过抑制胃肠道黏膜P-gp转运体的功能,提高口服紫杉醇的生物利用度,增强其抗H_(22)肿瘤作用;(6)灵芝三萜B8组分通过逆转由ABCB1介导的耐药作用,提高长春新碱对高表达P-gp的KBv200皮下移植瘤的抑制水平;(7)灵芝三萜B8组分对紫杉醇药物的代谢动力学不产生显著影响;综上研究表明了灵芝三萜B8组分在体内外能够有效地逆转由ABCB1介导的耐药作用,为分离出新型灵芝三萜单体化合物逆转耐药剂奠定良好的基础。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

多柔比星,三萜,罗丹明123,灵芝

37(与CTL组相比较， **， P <0.01)图1.2灵芝三萜B8组分作用于KBv200、KB细胞对多柔比星(A)以及罗丹明123(B)的蓄积情况Figure 1.2The effect of B8 on intracellular accumulation of DOX (A) and RH123 (B)inKBv200 and KB was measured by flow cytometric analysis, respectively.3.2 灵芝三萜 B8 抑制 ABCB1 介导的多柔比星外排将多柔比星与KBv200细胞共孵育3小时后，撤去多柔比星为阻断其蓄积来源，

灵芝,三萜,多柔比星,外排

38（**，P<0.01）图1. 3灵芝三萜B8组分作用于KBv200细胞对多柔比星的外排影响Figure 1.3 Effect of B8 on the efflux of DOX on KBv2003.3 灵芝三萜 B8 对 KBv200 细胞 ABCB1 基因转录、翻译水平无影3.3.1 对KBv200细胞ABCB1mRNA表达量无变化影响实时荧光定量PCR结果Tab1.4显示，通过求得的mRNA相对表达量2^DDC较，各实验处理组的2^DDCt均在1之间，说明各实验组ABCB1基因在mRNA的水平上既不显著上调也不显著下调，并且各实验组之间对ABCB1基因在mRNA达上无明显差异，因此可以得出，在不同作用时间以及不同浓度梯度下的灵芝

三萜,灵芝,组分

B8 50μg/mL 72h 1.098 0.867 0.895 0.953±0.126B8 100μg/mL 72h 0.966 1.185 0.940 1.030±0.134图1.4 灵芝三萜B8组分对KBv200细胞ABCB1 mRNA表达的影响Figure 1.4 Effect of B8 on ABCB1 mRNAexpression in KBv200 cell.

【参考文献】