祛风补肾方调控AMPK-mTOR信号改善高糖诱导的足细胞损伤机制研究

发布时间：2020-07-24 05:36

【摘要】：研究背景糖尿病肾病是糖尿病并发症中最常见的微血管并发症,其在糖尿病患者中的发病率为20%~40%,已经是导致终末期肾脏病最重要的单一因素。研究发现,肾小球滤过屏障的改变,尤其是其中足细胞因为自噬受到的损伤在DN的病理变化中起到关键的作用。多项研究表明,AMPK,mTOR、p53、JNK、SIRT1等相关信号通路的调控参与自噬,这些信号通路上关键蛋白的改变,在糖尿病肾病发展中具有重要作用。基于以上研究,本项目以离体培养肾小球小鼠足细胞作为实验对象,运用分子生物学方法研究祛风补肾方调控AMPK-mTOR信号改善高糖诱导的足细胞损伤的作用,以期发现祛风补肾方治疗糖尿病肾病的分子机制。为了更好的模拟祛风补肾方在机体内的药物作用,采用提取含药动物血清作为实验药物进行研究。目的通过观察祛风补肾方对条件性永生足细胞生长及其AMPK-mTOR信号通路和相关蛋白表达的影响,为祛风补肾方改善糖尿病肾病提供实验依据。方法1.高糖高渗对足细胞生长及相关蛋白表达的影响体外培养足细胞,MTT筛选高糖浓度及作用时间,实验分三组:正常组(5.6mmol/L葡萄糖)作为正常对照组、甘露醇组(5.6mmol/L葡萄糖+19.4mmol/L甘露醇)作为渗透压对照组、高糖组(25mmol/L葡萄糖)。足细胞培养24h后,流式细胞仪检测三组细胞凋亡情况,分析高糖高渗对细胞凋亡影响;Western Blot检测各组细胞AMPK、P-AMPK、mTOR、P-mTOR、Beclin-1、Nephrin、Podocin蛋白表达情况。2.高糖下调控AMPK-mTOR信号通路对足细胞相关蛋白表达的影响实验分五组:高糖组作为对照组,AMPK激动剂组、mTOR抑制剂组、AMPK抑制剂组、AMPK激动剂+mTOR抑制剂组,五组均在高糖条件下。体外培养条件性永生足细胞24h后,Western Blot检测各组细胞Beclin-1、Nephrin、Podocin蛋白表达情况。3.祛风补肾方对高糖诱导下足细胞生长及损伤的影响体外培养足细胞,MTT检测不同含药血清对足细胞生存率影响,选取两组做实验。实验分四组:正常组,高糖组,祛风补肾方低剂量组,祛风补肾方高剂量组。流式细胞仪检测四组细胞的凋亡情况。透射电镜下观察各组细胞自噬体的形成,观察各组自噬情况。4.祛风补肾方对高糖诱导的足细胞蛋白表达的影响实验分五组:正常组、高糖组、祛风补肾方低剂量组、祛风补肾方低剂量+AMPK抑制剂组、AMPK抑制剂组。体外培养足细胞24h后,Western Blot检测各组细胞AMPK、P-AMPK、mTOR、P-mTOR、Beclin-1、Nephrin、Podocin蛋白表达情况。结果1.MTT结果示,足细胞加药24h,葡萄糖浓度在25mmol/L时,高糖对足细胞损伤适中,模型稳定;流式细胞仪检测结果示,正常组与甘露醇组凋亡率无显著差别,高糖凋亡率明显升高;Western Blot结果示:高糖组较正常组Beclin-1表达明显升高,Nephrin、Podocin表达相对下降,P-AMPK/AMPK比值减少,P-mTOR/mTOR比值增加。甘露醇组与正常组比较无明显区别。2.Western Blot结果示:AMPK激动剂、mTOR抑制剂组及AMPK激动剂+mTOR抑制剂组较高糖组Beclin-1、Nephrin、Podocin表达明显升高,AMPK激动剂+mTOR抑制剂组尤为显著。AMPK抑制剂组较高糖组Beclin-1、Nephrin、Podocin表达相对下降。3.流式细胞仪检测结果示,祛风补肾方低、高剂量足细胞凋亡数目均较高糖组少,且低剂量优于高剂量。透射电镜结果示:高糖组细胞的自噬体比正常组有所增加,而祛风补肾方低剂量及高剂量的足细胞自噬体较高糖组均明显增多。4.Western Blot结果示:祛风补肾方低剂量组较高糖组上调Beclin-1、Nephrin、Podocin、P-mTOR/mTOR表达相对升高,P-AMPK/AMPK表达相对下降;祛风补肾方低剂量+AMPK抑制剂组则较祛风补肾方低剂量组Beclin-1、Nephrin、Podocin、P-mTOR/mTOR表达下降,P-AMPK/AMPK比值减少。结论1.足细胞在高糖刺激下可以产生自噬,且通过AMPK-mTOR信号通路增强足细胞自噬,可以减轻足细胞的损伤。2.祛风补肾方可以增强高糖下足细胞的自噬,减轻足细胞损伤。3.祛风补肾方可能通过AMPK-mTOR信号通路,从而促进足细胞自噬保护足细胞,改善高糖诱导下足细胞损伤。
【学位授予单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

足细胞,成活率,葡萄糖,杀伤力

实验结果实验结果1. 高糖及高渗状态下对足细胞生长及蛋白表达的影响1.1 高糖浓度的筛选MTT 结果示，在所选取的高糖浓度中，高糖浓度为 25m时间为 24 小时对高糖诱导下的足细胞杀伤力适中，模型相择 25mmol/L 的高糖刺激 24 小时的足细胞作为足细胞损伤模时间 48 小时，足细胞状态不佳，模型不稳定。

足细胞,高渗,凋亡,甘露醇

B 甘露醇组高糖下渗透压对足细胞形态的影响渗状下对足细胞凋亡的影响胞仪检测足细胞体外培养 24h 正常组亡状况，结果示：正常组及甘露醇组无显著差异（ P>0.05），但是高糖组组增加细胞凋亡率的主要原因，是因是高糖时渗透压改变。故高糖是造成

足细胞,下渗,凋亡

A 正常组 B 甘露醇组 C 高糖组图 2 高糖下渗透压对足细胞形态的影响1.3 高糖高渗状下对足细胞凋亡的影响流式细胞仪检测足细胞体外培养 24h 正常组、甘露醇组及高糖组三组的细胞凋亡状况，结果示：正常组及甘露醇组足细胞凋亡细胞数所占百分比数目无显著差异（ P>0.05），但是高糖组显著升高（ P<0.01）。故说明高糖组增加细胞凋亡率的主要原因，是因为高糖可以引起足细胞凋亡，而不是高糖时渗透压改变。故高糖是造成足细胞损伤的主要原因。

【参考文献】