安神益智法择时给药对AD模型小鼠认知与节律基因影响及作用机制分析

发布时间：2020-07-24 09:55

【摘要】：目的:从中医理论上探讨AD与老年失眠共同病因病机及相关性,进一步结合《内经》时间医学理论探讨安神益智法择时给药的合理性。通过动物实验观察安神益智法择时给药对AD小鼠认知及节律基因的影响以验证其有效性。为进一步阐明AD与失眠两者关系及安神益智法作用机制,使用GO富集分析、网络药理学、分子对接与动力学模拟等方法对两者关联基因、酸枣仁汤作用靶点、γ-氨基丁酸受体和乙酰胆碱酯酶做相关研究。方法:1.查阅AD与老年失眠相关中医文献,探讨两者共同病因病机。整理中医时间医学关于子午流注及营卫理论的研究,再结合择时给药相关文献探讨安神益智法择时给药的合理性。2.将90只小鼠分为空白组、模型组、安神组、益智组、早安神晚益智组、早益智晚安神组。使用D-半乳糖腹腔注射和左侧脑室注射Aβ_(1-42)制造复合型AD模型小鼠。给药组小鼠分7:00和19:00两个时间点给药,给药持续3周,灌胃给药安神方为酸枣仁汤,益智方为益智温胆颗粒。使用Morris水迷宫对各组小鼠进行定位巡航实验和空间探索实验来检测各组小鼠空间学习记忆能力。使用荧光定量Pcr法检测下丘脑Per1、Bmall、Clock昼夜节律基因和海马IDE基因表达水平。使用ELISA法检测海马IDE蛋白水平。3.在GeneCards数据库中检索AD与失眠有关基因,筛选出两者之间的重复基因建立AD与失眠关联基因数据库。使用Cluego对关联基因作GO生物过程富集分析和KEGG信号通路富集分析得出对两个疾病均有重要影响的信号通路,从而在信号通路层面上阐述两者之间的相关性。4.对酸枣仁汤有效成份中作用于AD与失眠关联基因的靶点作GO生物过程富集分析和KEGG信号通路富集分析,从而探索酸枣仁汤改善AD与失眠的共同作用机制。5.为进一步阐明酸枣仁汤改善AD与失眠的作用机制,选取GABA受体和AchE两个靶蛋白结构,使用分子对接和分子动力学模拟的方法对作用于两个靶点的成份进行半柔性对接和动力学模拟,以在微观层面上探索有效成份小分子与靶蛋白之间的相互作用结构及结合后的稳定性。结果:1.理论研究表明AD与老年失眠共同病机主要为肾虚与痰浊,其中以肾虚为主。根据子午流注理论与营卫理论提出的安神益智法择时给药治疗AD有一定的理论基础。2.动物实验中Morris水迷宫结果表明与空白组比较,AD模型组小鼠学习记忆能力下降(P0.05);与AD模型组比较,给药组小鼠学习记忆能力均有不同程度提高(P0.05,P0.01),其中以早安神晚益智组提高最为明显(P0.01)。RT-PCR结果表明相对于空白组,模型组Per1 mRNA、Bmall mRNA、Clock mRNA表达均下调,IDE mRNA表达上调。与模型组比较,给药组小鼠Per1 mRNA、Bmall mRNA、Clock mRNA、IDE mRNA表达均上调,早安神晚益智组IDE mRNA上调最为明显。海马组织IDE ELISA结果与PCR趋势一致,与空白组比较,其余各组小鼠海马组织内IDE含量明显升高(P0.05),早安神晚益智组IDE含量最高(P0.01)。3.AD与失眠关联基因富集分析结果表明两者之间的在生物过程方面的联系主要集中在神经肽信号通路、神经冲动传递、突触后膜电位的调节、髓细胞凋亡、炎症反应等,在KEGG信号通路方面的联系主要集中在神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、胰岛素分泌、细胞因子-细胞因子受体相互作用、JAK-STAT信号通路中。4.酸枣仁汤对于AD与失眠关联基因富集分析显示其作用机制在生物过程方面主要集中在类固醇分解过程、多巴胺转运、神经递质生物合成过程、凝血调节、纤维蛋白溶解的调节,在KEGG信号通路方面的联系主要集中在补体和凝血级联信号通路、血清素能突触、类固醇激素生物合成等信号通路中。5.GABA受体对接结果显示最优配体是MOL005018,AchE对接结果显示最优配体是MOL004966。分子动力学模拟结果显示MOL005018和MOL004966均能与对应的受体稳定结合。结论:1.AD与老年失眠共同病因病机主要为肾虚与痰浊,其中以肾虚为主。2.安神益智法中的早安神晚益智给药对于复合型AD模型小鼠的认知能力改善最佳。3.AD与失眠在多种生物过程和KEGG信号通路中密切相关。4.酸枣仁汤对AD和失眠共同作用机制是多方面的,主要集中在类固醇分解过程、多巴胺转运、神经递质生物合成过程、凝血调节、纤维蛋白溶解的调节、补体和凝血级联信号通路、血清素能突触、类固醇激素生物合成等信号通路中。5.酸枣仁汤作用于GABA受体和AchE的有效成份有多种,主要可能为MOL005018和MOL004966小分子。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

轨迹图,小鼠,路程,空白

与模型组比较，其它各组小鼠的上平台潜伏期均缩短(P<0.01，P<0.05)，空白组、益智组、早安神晚益智组、早益智晚安神组游泳总路程均有缩短（P<0.01，P<0.05）。与早益智晚安神组比较，早安神晚益智组上平台潜伏期缩短（P<0.05），游泳总路程减少(P<0.05)，益智组上平台潜伏期缩短，但差异没有统计学意义（P>0.05）。见下表。表 1-5 定位巡航实验结果（x±s，n=15）组别上平台潜伏期（s）游泳总路程（cm）上台前平均速度（cm/s）空白组 31.10±10.64** 365.49±75.36** 13.07±4.33模型组 61.10±24.66 735.83±143.24 13.04±3.69安神组 50.40±12.85* 816.86±118.13 15.13±4.34益智组 38.64±16.29** 403.39±95.21* 12.01±6.31早安神晚益智组 35.63±7.46**# 318.54±90.55**# 10.41±5.11早益智晚安神组 40.75±12.89* 342.89±78.18** 11.12±6.08与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01。与早益智晚安神组比较，#p<0.05。

轨迹图,空间探索,小鼠,模型小鼠

安神益智法择时给药对 AD 模型小鼠认知与节律基因影响及作用机制分析表 1-6 空间探索实验结果（x±s，n=15）组别穿平台次数目标象限时间（s）空白组 6.37±2.74** 44.61±12.47*模型组 1.56±0.62 22.37±7.74安神组 3.45±0.27* 30.02±12.34*益智组 5.72±1.37**# 44.19±12.58*早安神晚益智组 6.02±1.04**#▲ 46.69±15.18*早益智晚安神组 4.08±1.15** 45.56±11.63*与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01。与早益智晚安神组比较，#p<0.05。与益智组比较，▲p<0.05。

蛋白含量,中医药大学,硕士学位论文,统计学意义

湖北中医药大学 2019 届硕士学位论文△Ct 3.15±0.59 2.35±0.28 2.86±0.32 智组 -△△Ct -0.73 -1.26 -0.82 2-△△Ct0.60 0.42 0.57 △Ct 3.03±0.47 2.71±0.27 2.85±0.87 神组 -△△Ct -0.61 -0.81 -0.82 2-△△Ct0.66 0.57 0.57 A 检测海马组织 IDE 蛋白含量白组比较，其余各组小鼠海马组织内 IDE 含量明显升。与早益智晚安神组比较，早安神晚益智组 IDE），安神组升高，但是差异没有统计学意义（P>0.05

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