银杏酚C17:1通过促进自噬抑制巨噬细胞炎症反应

发布时间：2020-07-24 15:27

【摘要】：近年来,人们开始关注炎症和肿瘤的关系,慢性炎症往往和肿瘤的发生、发展密切相关。许多因素(如化学刺激、病毒感染、自身免疫损伤等)均可引起机体产生不同程度的慢性炎症。炎症会导致正常细胞DNA损伤、基因组不稳定、原癌基因突变、癌症细胞的浸润、迁移等。因此,抗炎疗法在癌症的预防和治疗中必不可少。目前临床上使用的甾体和非甾体抗炎药,在缓解炎症的同时存在极大的副作用。中药具有抗氧化、抑菌杀菌、降低血中及脏器中的内毒素水平等作用,在炎症的治疗过程中起到免疫干预作用。中西医结合作为一种新的治疗手段,有广阔的治疗前景。银杏作为中国的传统药物,在治疗疾病方面有上千年的历史。其中银杏酚C17:1(Ginkgol C17:1)是银杏酚单体之一,研究证实银杏酚C17:1有较高的抗瘤活性,但有关于其抗炎及作用机制尚未报道。近年来有许多研究表明自噬参与炎症性疾病。自噬直接抑制促炎复合物,并间接地清除受损细胞器或细胞内病原微生物。本文主要使用脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞作为炎症模型,通过观察炎性因子指标、氧化应激指标及自噬指标的变化,旨在从自噬方面阐述银杏酚C17:1对炎症的保护作用,为临床治疗炎症和拓展银杏酚的药理学作用提供理论依据。本实验的研究方法和内容:(1)应用MTT法检测银杏酚C17:1对巨噬细胞活性的影响。(2)应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测巨噬细胞上清液中炎症因子IL-6和TNF-α的浓度,确定LPS的最佳作用浓度和时间,建立细胞炎症模型。(3)应用实时定量PCR(quantitative reverse transcription PCR,q RT-pcr)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎症因子IL-6和TNF-α的m RNA相对表达量和在细胞上清液中的含量;应用Western Blot检测炎症小体NLRP3和IL-1β的蛋白表达量,分析银杏酚C17:1对炎症小体和炎症因子的影响。(4)荧光显微镜观察银杏酚C17:1对脂多糖刺激的巨噬细胞表达活性氧(ROS)的影响。(5)应用Western Blot检测脂多糖刺激后巨噬细胞TLR4、My D88、NF-κB、Phos NF-κB、ERK、Phos-ERK、STAT3、Phos-STAT3蛋白的相对表达量,分析银杏酚C17:1对TLR4信号通路的影响。(6)应用Western Blot检测银杏酚C17:1对脂多糖刺激后巨噬细胞表达自噬相关蛋白(Beclin1、LC3、P62)的影响。使用双标腺病毒RFP-GFP-LC3感染的细胞检测银杏酚C17:1作用巨噬细胞自噬流的变化。(7)加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,观察自噬相关蛋白(LC3、P62)的表达情况。应用q RT-PCR再次检测炎症因子IL-6和TNF-α的m RNA表达量,明确自噬在银杏酚C17:1抑制炎症反应中的作用。研究结果:(1)MTT结果表明浓度在0-80μg/ml范围内的银杏酚C17:1作用24 h对巨噬细胞的活性无明显影响。(2)ELISA结果表明LPS最佳作用浓度是100 ng/ml,最佳作用时间是12 h。(3)100 ng/ml的LPS诱导巨噬细胞12 h后,用40μg/ml的银杏酚C17:1处理24 h可降低炎症因子IL-6和TNF-α的m RNA水平以及在细胞上清中的相对表达量(P0.01 vs LPS);Western blot结果表明银杏酚C17:1可呈剂量依赖性抑制炎症小体NLRP3和IL-1β的蛋白表达水平。提示银杏酚C17:1对LPS诱导后巨噬细胞分泌的炎性因子有抑制作用。(4)荧光显微镜观察到银杏酚C17:1抑制LPS诱导的巨噬细胞中ROS的产生(P0.01 vs LPS),说明银杏酚C17:1干扰巨噬细胞自由基分泌功能。(5)Western blot结果表明LPS可以激活巨噬细胞的TLR4及下游蛋白。银杏酚C17:1可呈剂量依赖性降低TLR4、My D88、NF-κB、Phos NF-κB、ERK、Phos-ERK、STAT3、Phos-STAT3蛋白的相对表达量(P0.01 vs LPS),提示在LPS诱导的巨噬细胞中,抑制TLR4、NF-κB/ERK、STAT3等信号通路可抑制炎性因子的分泌。(6)Western blot结果表明LPS刺激巨噬细胞后,自噬相关蛋白(Beclin1、LC3)的表达稍低于空白组,自噬下游蛋白P62显著增加;而加入不同浓度银杏酚C17:1后,自噬相关蛋白(Beclin1、LC3)表达增加,P62降低,且呈浓度依赖性;同样,免疫荧光结果显示,加入银杏酚C17:1作用细胞后,自噬特异性蛋白LC3颗粒聚集增多,说明银杏酚C17:1可以诱导炎性状态下的巨噬细胞发生自噬。(7)加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,自噬相关蛋白LC3Ⅱ减少,P62堆积。实时定量PCR结果显示加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,炎症因子IL-6和TNF-α的m RNA表达量增加(P0.01 vs control)。提示LPS刺激后会减弱巨噬细胞的自噬能力,而银杏酚C17:1会诱导炎症状态下的巨噬细胞发生自噬,且比基础表达自噬水平更高。抑制自噬后,炎症因子表达增加,进一步说明自噬在银杏酚C17:1发挥抗炎过程中起到重要作用。结论:LPS诱导的炎症反应激活了巨噬细胞的TLR4信号通路,并抑制细胞自噬,而炎症状态下,银杏酚C17:1可以抑制TLR4信号通路,提高巨噬细胞的自噬功能,对抗细胞的炎性反应,此抑炎作用可能与银杏酚C17:1通过抑制TLR4、NF-κB/ERK、STAT3等信号通路及上调细胞自噬相关。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

巨噬细胞,组织修复,炎症,表型

巨噬细胞是构成先天免疫、体内平衡和其他炎症性疾病的关键组成部分。除了吞噬、免疫调节、提呈抗原等作用外，它还可以分泌细胞因子。巨噬细胞在活化后有两种不同的表型，即经典活化的巨噬细胞(称为 M1 表型)和交替活化的巨噬细胞（称为 M2 表型）[12, 15]。M1 型巨噬细胞一般通过 IFN-γ和细菌脂多糖 LPS活化，其特征是产生促炎性细胞因子（IL-1β、IL-6 和 TNF-α等），而 M2 表型参与抗炎性细胞因子（IL-4 和 IL-10）的分泌和组织修复[16, 17]。巨噬细胞可能通过极化为 M2 表型，发展成免疫抑制状态，参与炎症反应。Porta 及其同事发现LPS 耐受的巨噬细胞与 M2 巨噬细胞具有相同的特征[18]。不同类型的巨噬细胞对组织微环境的作用不同，参与和贯穿炎症性疾病的不同过程[19]。交替活化的巨噬细胞分泌抗炎介质，并通过多条信号途径包括 STATS、干扰素调节因子（IRFs）、NF-κB、AP1 和 PPARγ调节许多炎症性疾病发展过程中的免疫应答[20]。将巨噬细胞转化为适当的表型调节各种炎性疾病，将是未来临床治疗炎症的一个研究热点。

银杏酚酸,银杏酚

图 1.2 银杏酚酸的结构Fig 1.2 Structures of ginkgolic acids (A) ginkgols (B) and bilobol (C)（a）银杏酸(ginkgolic acids)（b）银杏酚(ginkgols)和（c）白果二酚(bilobol)有研究表明银杏酸易脱羧从而形成银杏酚类物质，银杏酚比银杏酸的结构稳定，生物活性更强。银杏酚由四种同系物单体组成：C13：0，C15：0，C11 和 C17：1，它们的主要区别在于烷基侧链的长度不同[30]。其中，Ginkgol C11 单体抑制肿瘤细胞活性的效果最为突出[31]。1.2.2 银杏酚的分离和纯化银杏提取物包含很多物质，已经分离纯化出的几种物质中只有少数有明确药理作用，其它的物质药效不明确,甚至可能具有致敏作用。银杏酸也具有皮致敏作用及细胞毒性，因此要求银杏制剂中银杏叶提取物中的含量须在 5×10

过程图,自噬,相关蛋白,过程

图 1.3 自噬相关蛋白和自噬过程[48]Figure 1.3 Autophagy-associated protein complexes and autophagy process注：自噬过程包含至少四个主要阶段，由 30 多种自噬相关（Atg）蛋白控制，并由两种泛素样结合系统介导，Atg12-Atg5 和 Atg8 / LC3：包括膜的启动，囊泡扩张、成熟和融合，以及溶酶体内膜及其内容物的最终降解。1.3.3 自噬与炎症的关系我们的研究重点讨论巨自噬（以下简称自噬），它与人类健康和疾病的关系也十分密切。自噬的基础组成水平通过消除受损/旧细胞器以及长寿命蛋白质和蛋白质聚集体的转换在细胞稳态中起重要作用，从而维持基本细胞组分的质量控制。另一方面，当细胞处于不良环境下，如缺乏营养、病原体感染、氧化应激、辐射或抗癌药物治疗，自噬可作为细胞的保护反应显著增加，从而导致适应和存活；然而，自噬失调或过度活化可能会导致细胞死亡。因此，有缺陷的自噬不仅与多种疾病相关，也和衰老有关[49]。自噬缺陷还会影响抗原肽的传递，形成慢性

【参考文献】