广金钱草中黄酮类化合物定性分析及其抗大鼠肾草酸钙结石作用的研究

发布时间：2020-07-24 16:03

【摘要】：泌尿系结石是一种世界范围的常见病、多发病,我国已经成为世界上三大泌尿系结石高发区之一,其中肾结石为我国泌尿系结石发病率最高的疾病,80%以上的肾结石属于草酸钙结石。目前肾结石中药疗法因为其无创伤、疗效显著、复发率小等明显优势,在临床上被越来越多的患者所接受。但是中药的用法用量是根据古代经典著作和长期的临床实践经验总结所得,缺乏系统、科学的分析,所以对防治肾结石中药的研究是十分必要的。广金钱草(Herba Desmodii Styracifolii)为豆科植物广金钱草Desmodium styracifolium(Osb.)Merr.的干燥地上部分,是中国传统中药之一,具有抗炎、退热、利尿通淋等作用,临床上主要用于泌尿结石的治疗。广金钱草含有黄酮类、皂苷类、酚酸类和生物碱类等化学成分,其中黄酮类化合物是其主要的药理活性成分。虽有文献报道广金钱草有抗氧化作用,对大鼠有明显的利尿作用和肾保护作用,可抑制肾结石的形成,但是其抗肾结石的机制尚不明确,仍需进一步的研究。本研究采用液质联用(UHPLC-Q-TOF-MS/MS)技术,对广金钱草中黄酮类化合物进行定性分析,为其进一步的药效物质研究奠定基础。建立同时测定尿液中草酸和柠檬酸浓度的高效液相色谱法和同时测定大鼠尿液和血清中多种化学元素含量的电感耦合等离子体质谱法,为广金钱草抗肾结石作用的药效评价及机制研究提供方法。通过灌胃给予广金钱草提取液,观察其对肾草酸钙结石模型大鼠尿液和血清相关指标的影响及肾草酸钙结晶的形成情况,初步探讨广金钱草抗肾结石的药效及作用机制。第一部分液质联用法同时鉴定广金钱草中51种黄酮类化合物目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法分离鉴定广金钱草中多个黄酮类化合物。方法:色谱柱为Agilent SB-C_(18)(100 mm×2.1 mm,2.7μm),流动相为乙腈-0.1%乙酸溶液,梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,进样量为2μL;电喷雾离子源,负离子模式检测。首先把广金钱草中已知的23种黄酮类化合物的对照品溶液针泵进样到质谱仪,进行一级质谱扫描、母离子扫描和子离子扫描,通过对离子碎片的解析,总结裂解规律;广金钱草提取物经液相分离后进行质谱分析,联合采用数据处理软件Peakview 1.2中的“IDA Explore”和“MasterView”功能,根据已知化合物的质谱裂解规律和未知化合物的碎片信息对广金钱草中的黄酮类化合物进行结构鉴定。结果:鉴定出了广金钱草中的51个黄酮类化合物,其中包括4个黄酮苷元,26个黄酮碳苷,5个黄酮氧苷,3个黄酮醇苷元,3个黄酮醇氧苷,2个二氢黄酮苷元,1个二氢黄酮氧苷,1个异黄酮苷元,2个异黄酮氧苷和4个二氢异黄酮。其中23个化合物通过与对照品对比确证了结构,其余28个化合物则通过质谱碎片信息推断出了可能的结构,误差范围在±5 ppm之间。结论:本研究首次采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法对广金钱草中多个化学成分进行了结构鉴定,为其进一步的药效物质研究奠定了基础。第二部分HPLC法同时测定大鼠尿液中草酸和柠檬酸浓度目的:建立同时测定大鼠尿液中草酸和柠檬酸浓度的高效液相色谱法。方法:采用Cosmosil PBr色谱柱(250×4.6 mm,5μm),以0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.01 mol/L四丁基硫酸氢铵、2.69×10~-55 mol/L EDTA)为流动相,流速为1.0 mL/min,检测波长210 nm。大鼠尿液采用磺基水杨酸法沉淀蛋白。结果:尿液中草酸和柠檬酸的峰面积与浓度在一定范围内线性关系良好,相关系数r均大于0.99。草酸和柠檬酸批内与批间精密度的RSD范围分别为3.7%~7.8%和3.2%~5.1%,RE均在±15%内。两者平均提取回收率为85.9%~91.6%,RSD均小于8.3%。结论:本文建立的HPLC法,灵敏度高、专属性强,操作简便快速,为广金钱草的抗肾结石机制研究奠定了基础。第三部分ICP-MS法同时测定大鼠体内多种元素浓度目的:建立电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法同时测定大鼠尿液和血清中多种元素的含量。方法:样品处理方法为直接稀释法,采用2%的硝酸把尿液和血清样品分别稀释10倍和20倍,用前摇匀。ICP-MS工作参数:射频功率:1500 W,反射功率:2 W,载气流速:1.1 L/min,等离子气流速:15 L/min,泵速:0.3 r/min,雾化室温度:2°C,校准方式为内标法。结果:尿液和血清样品中18种待测元素浓度与比率在测定浓度范围内线性关系良好,相关系数r均大于0.99,检测限、定量限、仪器精密度、重复性和稳定性均符合要求,尿液和血清中待测元素的加样回收率范围分别为99.1%~104.1%和93.1%~114.3%,RSD小于15%。结论:该法灵敏度高、重现性好,能快速准确的同时测定尿液和血清中多种元素的含量,通过比较不同情况下大鼠体内各元素含量变化,可为广金钱草抗肾结石作用的药效评价及机制研究奠定基础。第四部分广金钱草抗大鼠肾草酸钙结石作用的研究目的:研究广金钱草对大鼠肾草酸钙结石形成的影响,并对其作用机制进行初步探讨。方法:采用1%乙二醇和2%氯化铵诱导的肾草酸钙结石大鼠模型进行研究,大鼠随机分为为4组(n=8):空白组(自由饮水)、成石组(1%乙二醇和2%氯化铵)、广金钱草小剂量组和广金钱草大剂量组(1%乙二醇和2%氯化铵+不同剂量的广金钱草提取物),饲养28天后,收集各组大鼠的尿液和血清,对尿液中24 h尿草酸和柠檬酸含量和尿液、血清中多种化学元素浓度进行检测,并用显微镜观察尿涂片和肾组织切片中草酸钙结晶及肾小管扩张情况。结果:与成石组相比,广金钱草小剂量和大剂量组尿草酸含量显著降低(P0.05),而柠檬酸含量显著升高(P0.05),尿液中Mg、Fe和Mo浓度升高(P0.05),Ca、Cu等化学元素浓度降低(P0.05)。与成石组相比,广金钱草大剂量组血清中As浓度升高(P0.05),Pb浓度降低(P0.05)。而四组大鼠血清中其余元素浓度没有统计学差异(P0.05)。显微观察结果表明,广金钱草能减少肾结石大鼠尿液及肾组织中草酸钙结晶,缓解肾小管扩张。结论:广金钱草对肾草酸钙结石形成有抑制作用,可能通过降低尿草酸含量以及影响尿液中钙、镁等化学元素含量来抑制结晶在肾中的沉积,从而发挥抑制肾草酸钙结石的作用,并通过利尿作用促进结石的排出。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284.1;R285.5
【图文】：

黄酮,碎片离子,负离子

黄酮O-苷（a）和黄酮C-苷（b）类碎片离子的命名lature adopted for various saccharide pdes (a) and C-Glycosides (b) in negati

木犀草素,裂解规律,二级质谱

28图 2 木犀草素的二级质谱图和裂解规律Fig. 2 The MS/MS spectrum and fragmentation pathway of luteolin

牡荆素,裂解规律,二级质谱

29图 3 牡荆素的二级质谱图和裂解规律Fig. 3 The MS/MS spectrum and fragmentation pathway of vitexin

【参考文献】