密枝圆柏的活性成分研究

发布时间：2020-07-25 16:22

【摘要】：背景密枝圆柏(Juniperus convallium)为柏科(Cupressaceae)刺柏属(Juniperus)植物,是我国特有树种,主要分布在西藏和四川西部地区。刺柏又称徐巴‖,作为传统藏药,在我国有着悠久的用药历史,因其具有清热、解毒、祛湿的功效,被广泛用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肺炎、肾炎、黄水病等疾病。文献报道,风湿及类风湿关节炎等疾病的发生不仅与补体系统的过度激活有关,还与氧化应激产生的自由基相关。现代药理研究也表明,刺柏属植物在抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、杀虫等方面均表现出较好的生物活性。刺柏属植物中的化学成分多样,主要包括挥发油、萜类、黄酮、木脂素、香豆素、甾体等。密枝圆柏为刺柏属代表性植物之一,国内外鲜见对其化学成分和生物活性方面的研究。因此,本文对密枝圆柏的化学成分及其生物活性进行研究具有重要意义。目的六种刺柏属植物枝叶和果实部位的挥发性成分,为研究刺柏属植物不同部位及不同品种间的药效差异提供参考。分离鉴定密枝圆柏乙醇提取物中化合物的结构,并测定化合物的抗补体、抗氧化和抗流感病毒活性,为阐明密枝圆柏的药效物质基础提供一定的参考。方法1.采用HS-GC-MS法对密枝圆柏、高山柏、垂枝香柏和香柏的枝叶及大果圆柏与滇藏方枝柏的枝叶和果实中挥发性成分进行分析,利用NIST14谱库并结合相对保留指数对分离得到的化合物进行结构鉴定,采用面积归一法确定各组分相对百分含量,并采用Ward's聚类法对枝叶部分的挥发性成分进行聚类。2.采用正相硅胶、ODS-C_(18)和Sephadex LH-20及制备型高效液相色谱等方法对密枝圆柏乙醇提物进行分离纯化,结合理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。采用细胞溶血法测定各萃取部位的抗补体活性,并采用该方法测定化合物的经典、旁路途径抗补体活性及作用靶点,采用DPPH、ABTS、FRAP法测定化合物抗氧化活性,采用MTT法测定体外抗流感病毒活性。结果1.从6种刺柏属植物中共鉴定出62个化合物,占各样品总成分的90.08%~98.82%,包括单萜烯类化合物15种、含氧倍半萜类化合物11种、倍半萜烯类化合物20种、含氧二萜类化合物2种、含氧单萜类化合物12种和异戊酸酯类化合物2种,其中α-蒎烯、β-蒎烯等单萜烯类成分含量较高。果实部位单萜烯含量高达80%以上,且主成分β-蒎烯含量超过45%,与枝叶部位挥发性成分存在显著差异。聚类分析结果显示,大果圆柏、滇藏方枝柏、高山柏和香柏挥发性成分相似度较高,均以β-蒎烯含量最高,而密枝圆柏和垂枝香柏的主要成分分别为α-蒎烯和α-松油烯。2.密枝圆柏醇提物的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位为抗补体活性有效部位,从密枝圆柏乙酸乙酯部位分离鉴定了17个化合物,包括黄酮类化合物9个:穗花杉双黄酮(1)、柏黄酮(2)、Cupressuflavone-4?-O-β-D-glucosides(3)、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(4)、芹菜素(5)、山柰酚-3-O-(6''-O-E-肉桂酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(7)、槲皮素鼠李吡喃糖苷(8)和海波拉亭-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9);木脂素类化合物3个:Isomassonianoside B(10)、异落叶松脂素-2a-O-D-葡萄糖苷(11)和异落叶松脂素-3a-O-D-葡萄糖苷(12);萜类化合物3个:柳叶二醇(13)、3β-羟基山达海松酸(14)和(1R,3R,4aR,4bS,7R,10aR)-7-ethenyl-1,2,3,4,4a,4b,5,6,7,9,10,10a-dodecahydro-3-hydroxy-1,4a,7-trimethyl-1-phenanthrenemethanol(15);以及大丁苷元(16)和β-谷甾醇(17)。除16外,不同类型化合物对补体系统均具有不同程度的抑制活性,经典途径CH_(50)为0.05~3.99 mM,旁路途径AP_(50)为0.58~19.13mM,其中,黄酮类化合物,尤其双黄酮类,是密枝圆柏中重要的抗补体活性成分,并且酚羟基和糖苷基团可能是影响其抗补体活性的重要因素。黄酮类化合物(1~3,5~9)和木脂素类化合物(10~12)化合物具有不同程度的抗氧化活性。黄酮类化合物2和6具有较弱的抗流感病毒活性。结论1.刺柏属植物枝叶和果实的挥发性成分存在显著差异,且枝叶主成分差异为不同植物分类的主要因素。HS-GC-MS法是一种能够简便快捷地分析该属植物挥发性成分的方法。2.化合物(1~17)均为首次从密枝圆柏中分离得到,黄酮和木脂素类是其抗补体和抗氧化的主要活性成分,为密枝圆柏药效物质基础及质量控制研究提供了依据。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.1;R285.5
【图文】：

刺柏,标本,不分流

图 1-1 6 种刺柏属植物标本图Fig. 1-1 The plants of 6 Juniperus species验方法顶空进样条件分别精密称取0.002 g干燥的6种刺柏属植物枝叶和大果圆柏及滇藏方枝末，放入20 mL顶空瓶中，密封后置于样品盘内。进样体积：2 mL；流速in；不分流；加热温度：120oC；加热时间：20 min；震动速度：400 rpm序：加热10 s，静止10 s。气相色谱条件TG-5MS 石英毛细管非极性柱（30 m×0.32 mm×1.00 μm）；载气 He；柱流L/min；进样口温度 250oC；柱温程序：起始柱温 40oC（保持 8 min），以 1oC 250oC（保持 30 min）；进样量 1 μL，不分流。

刺柏,枝叶,挥发性成分,总离子流

在上述实验条件下对正构烷烃标准品，刺柏属植物密枝圆柏、高山柏、垂枝香柏和香柏的枝叶以及大果圆柏和滇藏方枝柏枝叶和果实的挥发性成分进行HS-GC-MS分析，分别得到总离子流图，见图1-2（样品及主峰编号同表1-2）。图 1-2 六种刺柏属植物枝叶和果实挥发性成分总离子流图Fig. 1-2 GC-MS chromatogram of volatile components from twigs and fruits of 6 Juniperusspecies

刺柏,枝叶,聚类分析

图 1-3 6 种刺柏属植物枝叶的聚类分析Fig. 1-3 Cluster analysis of the twigs of 6 Juniperus species统蒸馏法的比较称取20、10、5、2 mg刺柏属植物枝叶和果实粉末，果显示当样品量为5和2 mg时，分离色谱峰效果较好本实验与已报道的传统水蒸气法对比，涂永勤从10发性成分，董艳芳称取200 g垂枝香柏提取其挥发油，不需提取，操作简便快捷。结果的探讨-MS法基本可以将刺柏属植物果实和枝叶部分从挥主成分含量占比较高，对区分不同部位及不同品种

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