中药单体华蟾素抗人结肠癌细胞作用和机制研究

发布时间：2020-07-27 08:27

【摘要】：研究目标:观察中药单体华蟾素(Cinobufagin,简称为CBG)抗结肠癌(Colon cancer)细胞作用,明确其作用机制。研究方法和内容:四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、细胞集落试验(Clonogenicity assay)、Brd U酶联免疫吸附测定(ELISA)检测华蟾素处理不同时间后,对结肠癌细胞存活及细胞增殖的影响;TUNEL细胞核染色方法、Annexin V-碘化丙啶(PI)流式细胞仪(FACS)法,及Histone-DNA ELISA法、检测华蟾素对结肠癌细胞凋亡的作用;碘化吡啶(PI)流式细胞仪法观察CBG干预后结肠癌细胞周期的变化;运用免疫印迹(Western blot)方法检测CBG干预后结肠癌细胞内质网应激(ER应激)、m TOR复合物1(m TORC1)等信号通路水平的活化水平;导入持续活化的S6K1质粒(CA-S6K1),观察药物干预后CBG体外抗结肠癌细胞活性的变化;建立裸鼠荷瘤模型,观察CBG在体抗结肠癌细胞的活性。研究结果:CBG显著抑制人结肠癌细胞及原代人结肠癌细胞的存活和增殖。CBG对正常人结肠上皮细胞无显著毒性作用。CBG诱导结人结肠癌细胞凋亡,并导致结肠癌细胞周期G2-M期阻滞。CBG激活结肠癌细胞内ER应激通路。使用内质网应激抑制剂(Salubrina),caspase-12抑制剂(z ATADfmk)或CHOP沉默(通过目的性sh RNAs)的方法能够明显的减弱CBG诱导的结肠癌细胞的死亡和凋亡。CBG抑制结肠癌细胞内m TORC1的活化,而导入持续活化的S6K1质粒抑制CBG诱导的抗增殖作用。CBG腹腔注射抑制裸鼠中HCT-116皮下移植瘤生长。分析肿瘤组织发现,CBG干预的瘤组织中存在CHOP上调和m TORC1失活。研究结论:CBG具有显著的体外及在体抗结肠癌细胞作用,其作用机制可能和其激活ER应激和抑制m TORC1有关。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

华蟾素,结肠癌细胞,克隆形成,毒性作用

即抑制 50％HCT-116 细胞存活的浓度小于 50 ng/mL（图1a）。而最低浓度的 CBG（1 ng/mL）未能显著影响 HCT-116 细胞的存活（图 1a）。与此同时，CBG 还时间依赖性抑制 HCT-116 细胞存活（图 1a），在 CBG（50-250ng/mL）干预后 24 小时后，就注意到显著的细胞活力降低，并且在 48 和 72h 时更显著（图 1a）。我们还检测了 CBG（100 ng/mL，48 小时）对其它人结肠癌细胞株的影响。HT-29 也是一种常见的结肠癌细胞株。研究证实，添加 100ng/mL 的 CBG 同样对 HT-29 细胞具有细胞毒性（图 1b）。用指定浓度（1-250 ng/mL）的华蟾素（Cinobufagin，简称为 CBG）干预人结肠癌（Colon cancer）HCT-116（图 1a）和 HT-29（图 1b）细胞株，进一步培养细胞指定时间；通过MTT方法检测细胞存活率。“Ctrl”代表未经CBG干预的对照组。* p <0.05vs. “Ctrl”组。该图中的实验重复五次

华蟾素,克隆形成,结肠癌细胞,机制研究

第一部分中药单体华蟾素抗人结肠癌细胞作用和机制研究用指定浓度（1-250 ng/mL）的华蟾素（Cinobufagin，简称为 CBG）干预人结肠癌（Colon cancer）HCT-116（图 2a）和 HT-29（图 2b）细胞株，每 2 天更新 CBG 干预共 5 次，后观察并计数克隆数目。“Ctrl”代表未经 CBG 干预的对照组。* p <0.05 vs.“Ctrl”组。该图中的实验重复五次，得到相似的结果。每次重复 n = 5。

华蟾素,结肠癌细胞,上皮细胞,细胞毒性

图 3 华蟾素抑制人结肠癌细胞株增殖4 华蟾素抑制原代培养的人结肠癌细胞存活我们还检测了 CBG 对其他人结肠癌细胞的影响。本研究中，我们原代培养了 2株人结肠癌细胞，其分别命名为“Pri Colon-1 / -2”。 MTT 结果证实，用 CBG（100ng/mL，48 小时）干预显著降低了原代培养人结肠癌细胞的存活（图 4a）。同时，相同的 CBG 干预也对 PANC-1 胰腺癌细胞 [19-23]具有细胞毒性（图 4a）[21]。值得注意的是，CBG（100 ng/mL，48 小时）干预对人原代结肠上皮细胞（“Colon Epi”）和HPDE6c7 胰腺上皮细胞（“Pan Epi”）[23, 24]无显著的细胞毒性作用（图 4b）。CBG（100 ng/mL，48 小时）干预后，上述上皮细胞的 MTT OD 值无显著变化（图 4b）。这些结果表明 CBG 对癌细胞具有选择性的细胞毒性。100 ng/mL 的华蟾素（Cinobufagin，简称 CBG）干预上述癌细胞（图 4a）或非癌性上皮细胞（图 4b）进一步培养细胞 48 小时；通过 MTT 方法检测细胞存活率。“Ctrl”代表未经 CBG 干预的对照组。* p <0.05 vs. “Ctrl”组。该图中的实验重复

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