川陈皮素调节大鼠血压的功能性研究及分子机制

发布时间：2020-07-27 09:47

【摘要】：本研究以柑橘多甲氧基黄酮提取物中的主要活性成分之一川陈皮素为研究主体,分别在SD大鼠体内体外实验中,探索了川陈皮素的血管舒张效应,并且深入探讨了川陈皮素引起血管舒张效应的具体分子机制及相关舒张、收缩因子的变化,为进一步开发利用柑橘多甲氧基黄酮提取物及其活性成分川陈皮素作为功能食品或药品的使用提供理论依据。SD大鼠体内实验中,首先选取200-250g雄性SD大鼠,腹腔注射15mg/kg/d NG-硝基-左旋精氨酸(L-NNA)28d,制作内皮损伤型高血压大鼠模型,分成6组,即正常对照组(生理盐水组),造模组(L-NNA模型组),剂量组:L-NNA+川陈皮素低剂量组(1.8mg/kg/d),L-NNA+川陈皮素中剂量组(3.6mg/kg/d),L-NNA+川陈皮素高剂量组(7.2mg/kg/d)和阳性对照组(替米沙坦组80mg/Kg/d),每组设5只平行大鼠。灌胃共计28d,检测以下指标变化:(一)分别于14d和28d时通过尾套法测量大鼠尾动脉血压及心率变化和天平称量大鼠体重变化;(二)于28d后,采集各实验组大鼠的动脉血,酶联免疫试剂盒测定四种与血管收缩舒张有关的活性因子(PGI2,ANG2,EDHF和总NO)的含量;(三)于28d后,采集各实验组大鼠胸主动脉、心脏组织和肾脏组织,经HE染色后,观察组织结构变化。研究结果表明:(一)SD大鼠L-NNA腹腔注射28d后,与生理盐水组相比,血压明显升高,≥140mm Hg,且血压上升20mm Hg,表示高血压大鼠模型造模成功。(二)阳性对照药替米沙坦组造模后与造模前相比,血压显著升高,为178±9.08 mm Hg,具有统计学意义,P0.05,给药14d后与造模后相比,血压显著降低为123±1.56 mmHg,具有统计学意义,P0.05,给药14d后与给药28天后相比,血压降低无统计学意义;川陈皮素低剂量组造模后与造模前相比,血压显著升高,为184±29.46 mm Hg,具有统计学意义,P0.05,确认造模成功,给药14d后与造模后相比,血压显著降低,为127±11.59 mm Hg,具有统计学意义,P0.05,给药28d后与给药14天后相比,血压降低无明显变化,为135±13.23mm Hg,无统计学意义。川陈皮素中剂量组造模后与造模前相比,血压显著升高,为196±34.02 mmHg,具有统计学意义,P0.05,确认造模成功,给药14d后与造模后相比,血压显著降低,为124±9.00 mm Hg,具有统计学意义,P0.05,给药28d后与给药14d天后相比,血压降低无明显变化,为127±9.64 mm Hg,无统计学意义。川陈皮素高剂量组造模后与造模前相比,血压显著升高,为175±5.51 mm Hg,具有统计学意义,P0.05,确认造模成功,给药14d后与造模后相比,血压显著降低,为137±7.21 mm Hg,具有统计学意义,P0.05,给药28d后与给药14天后相比,血压降低无明显变化,为142±10.50 mmHg,无统计学意义。但各剂量组间无统计学差异,且与阳性对照组相比,也无明显差异,无统计学意义。并且各组间大鼠体重及心率无明显变化,无统计学意义;此结果说明在高血压大鼠模型中,川陈皮素可显著降低大鼠血压;(三)酶联免疫试剂盒检测结果显示:(1)PGI2含量的变化:川陈皮素低剂量组与造模组比较,川陈皮素对实验大鼠动脉血中的PGI2含量的变化的影响无统计学意义;川陈皮素中剂量组与低剂量组和造模组,正常组相比,PGI2含量显著升高,为79.0±6.3 ng/L,具有统计学意义,P0.05;川陈皮素高剂量组与中剂量组相比,川陈皮素对实验大鼠动脉血中的PGI2含量的影响无统计学意义,而与低剂量组和造模组,正常组相比,PGI2含量显著升高,为89.8±4.0 ng/L,具有统计学意义,P0.05;(2)ANG2含量的变化:川陈皮素低,中,高三个剂量组在处理前后,实验大鼠动脉血中的ANG2含量均没有明显升高或降低,与正常对照组,造模组及阳性对照组相比,无统计学意义;(3)EDHF含量的变化:川陈皮素低,中,高三个剂量组在处理前后,实验大鼠动脉血中的EDHF含量均没有明显升高或降低,与正常对照组,造模组及阳性对照组相比,无统计学意义;(4)总NO含量的变化:川陈皮素低剂量组与造模组和正常组相比,川陈皮素可显著增高实验大鼠动脉血中的总NO含量,为91.3±3.9 ng/L,具有统计学意义,P0.05;川陈皮素中剂量组与造模组和正常组相比,总NO含量显著升高,为89.0±6.3 ng/L,具有统计学意义,P0.05;川陈皮素高剂量组与造模组和正常组相比,川陈皮素显著增加实验大鼠动脉血中的总NO含量,为90.8±4.0 ng/L,具有统计学意义,P0.05,但各剂量组间,总NO含量无明显差异,无统计学意义,且与阳性对照组相比,也无明显差异,无统计学意义。此结果说明在高血压模型大鼠中,川陈皮素介导的大鼠的抗高血压效应与血浆中的PGI2和总NO含量有关,而与ANG2和EDHF含量无关;(四)HE染色后,显微镜下观察,发现各实验组间,大鼠胸主动脉,心脏组织和肾脏组织的结构均无明显病理改变。大鼠体外实验中,选取200-250g雄性SD大鼠,分离肠系膜动脉和肺动脉,(一)给予基础张力后,10-6M苯肾上腺素(phenylephrine,PE)预收缩,加入10-9-10-5M的川陈皮素,采用血管环组织浴槽测定血管张力的变化,实验结果表明10-5M川陈皮素可明显诱导大鼠离体肠系膜动脉舒张,舒张率为36.87±3.57%,且呈浓度依赖性,EC50值为16.34±5.61μM,而对离体肺动脉无舒张效应;(二)在去除内皮层的大鼠离体肠系膜动脉血管环中,10-6M PE预收缩后,加入10-9-10-5M的川陈皮素,观察血管张力的变化,发现川陈皮素介导的大鼠离体肠系膜动脉的血管舒张效应几乎消失,说明川陈皮素引起的大鼠离体肠系膜动脉的舒张呈内皮依赖性;(三)在内皮完整的大鼠离体肠系膜动脉血管环中,一氧化氮合酶(e NOS)抑制剂ι-NAME(10-4M)孵育30min,10-6M PE预收缩后,加入10-9-10-5M的川陈皮素,发现川陈皮素介导的大鼠离体肠系膜动脉血管舒张率明显下降,为21.90±2.06%,说明川陈皮素引起的大鼠离体肠系膜动脉的舒张效应与血管内皮细胞的e NOS部分相关;(四)在培养的大鼠主动脉内皮细胞中,加入10-5M川陈皮素后,提取细胞蛋白,检测川陈皮素对总e NOS蛋白的表达和磷酸化e NOS活力的影响,结果表明与对照组相比,10-5M川陈皮素可明显增强p-e NOS-1177的活性,但不影响总e NOS蛋白的表达,而e NOS的抑制剂ι-NAME可抑制磷酸化e NOS的活性,说明川陈皮素通过增加p-e NOS-1177的活力来介导血管舒张;(五)在培养的大鼠主动脉内皮细胞中,加入10-5M川陈皮素后,荧光探针检测了NO产物的含量,结果表明川陈皮素可明显增加大鼠主动脉内皮细胞中NO产物的含量,而加入e NOS的抑制剂ι-NAME后,川陈皮素介导NO产物增加的效应被抑制,此结果说明川陈皮素通过激活p-e NOS-1177,增加NO产物含量,介导血管舒张;(六)在内皮完整的大鼠离体肠系膜动脉血管环中,分别孵育PI3K/AKT抑制剂Wortmannin,PKA抑制剂H-89,SIRT1的抑制剂Nicotinamide和RORs的抑制剂SR100130min,PE预收缩后,加入10-9-10-5M的川陈皮素,观察血管张力的变化,结果表明川陈皮素介导的大鼠离体肠系膜动脉的血管舒张效应无明显变化,说明川陈皮素舒张大鼠离体肠系膜动脉与PI3K/AKT,PKA,SIRT1和RORs信号通路无关;(七)在内皮完整的大鼠离体肠系膜动脉血管环中,应用无钙液替换有钙液后,加入10-9-10-5M的川陈皮素,观察血管张力的变化,结果表明川陈皮素介导的大鼠离体肠系膜动脉的血管舒张率显著变小,为12.83±2.22%,具有统计学意义,此结果说明血管内皮细胞中的Ca2+参与了川陈皮素介导的大鼠离体肠系膜动脉的血管舒张效应;(八)在培养的大鼠主动脉内皮细胞中,加入10-5M川陈皮素后,观察内皮细胞中Ca2+浓度的变化,结果表明与正常对照组相比,川陈皮素可显著增加大鼠主动脉内皮细胞中的Ca2+含量,为1.24±0.13,有统计学意义,此结果说明川陈皮素可显著提高大鼠主动脉内皮细胞中的Ca2+浓度,高浓度的Ca2+可激活内皮细胞的磷酸化e NOS,促进NO产生,发挥血管舒张效应;(九)在培养的大鼠主动脉内皮细胞中,孵育Ca2+释放通道IP3受体的拮抗剂2-APB 30min,加入10-5M川陈皮素后,观察川陈皮素对内皮细胞内Ca2+浓度影响的变化,结果表明在抑制细胞内钙释放后,川陈皮素介导的大鼠主动脉内皮细胞中的Ca2+含量增加的效应明显被抑制,为0.93±0.008,与正常对照组相比,具有统计学意义,P0.01。另外应用无钙液代替有钙液后,川陈皮素诱导的大鼠主动脉内皮细胞中的Ca2+含量也明显降低,为0.98±0.01,与正常对照组相比,具有统计学意义,P0.01,此结果说明川陈皮素介导的大鼠主动脉内皮细胞中Ca2+含量的增加来源于细胞内钙的释放和细胞外钙的内流。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

柑橘,资源丰富

片剂等[18]。1.2.2 柑橘多甲氧基黄酮提取物我国柑橘类产品资源丰富（图 1-1），加工及贮藏过程中浪费严重，为了合理利用柑橘类产品，可以通过提取、分离、纯化得到柑橘多甲氧基黄酮提取物，来提高柑橘类产品的利用率，延长柑橘类产品的使用寿命，拓宽柑橘类产品的应用范围。柑橘多甲氧基黄酮提取物具有多种生理活性，例如抗菌、抗炎，抑制病毒，通过消除氧自由基发挥抗氧化作用，抑制肿瘤生长发挥抗癌作用等多种功效[6]，因此近年来深受到研究者的关注。

川陈皮素,化学结构式

常温下，在水中的溶解度仅为 0.1%，升至 75℃时，溶解度达 10%。微溶于乙醚，溶于石油醚，苯，氯仿等。通常避光保存于阴凉干燥处。川陈皮素来源广泛，可从芸香柑橘属的皮，茎，叶，枝等的提取物中通过醇提，萃取，层析及结晶方法获得，为柑橘甲氧基黄酮化合物中的主要成分之一，另外也可以通过化学合成的方式获得。研究表明，陈皮素具有多种功效，可用于食品加香剂和食品保鲜剂，具有抗炎，抗肿瘤，抗过敏，高记忆力，抗动脉粥样硬化，改善血管活性等[15]多种生物活性。

路线图,川陈皮素,全合成,路线图

图 1-3 川陈皮素全合成路线图Fig.1-3 The whole synthetic route of Nobiletin川陈皮素的检测目前一般通过 HPLC 及 GC-MS 等方法来检测，但由于川陈皮素来源广泛，其中所含干扰因素较多，因此对于检测方法及条件的优化，仍在进一步探索中。1.2.3.3 川陈皮素的代谢产物采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用（UPLC-MS/MS）技术分析川陈皮素在体内的代谢产物，经综合分析后，共得到 7 个代谢产物。其中 I 相代谢产物为 3 个，由川陈皮素分别脱去一个和两个甲基所得。II 代谢产物为 4 个，由 I 相代谢产物经硫酸化和葡糖醛酸化生成（图 1-5）[15]。川陈皮素的代谢产物大多也具有生物活性。如 Wu X 等[42]研究发现在 LPS 处理的RAW264.7 细胞中，4’- demethylnobiletin（4DN）不仅可抑制 LPS 诱导的 NO 产生，还可明显减少前炎症因子 PGE2，IL-1β 和 IL-6 的表达，也可抑制 NF-κB 和 AP-1 的核转位。而且 4DN 还可激活转录因子 Nrf2 及其下游基因 HO-1 和 NQO1，有助于由炎症引起的疾病的治疗。Lai CS 等[43]研究了川陈皮素的代谢产物 3’, 4’-didemethylnobiletin（DDMN）的抗炎和抗肿瘤活性，结果表明 DDMN 在小鼠皮肤组织中，可通过下调 iNOS，COX-2 和 ODC基因的表达，发挥有效的抗炎和抗肿瘤效应，揭示或可被抑制与炎症相关的肿瘤生长。Tung[44]

【参考文献】