丙戊酸钠联合复方丹参滴丸对癫痫大鼠抗痫作用的研究

发布时间：2020-07-27 11:26

【摘要】：目的脑立体定位技术向大鼠海马注入红藻氨酸(KA)建立癫痫模型,利用复方丹参滴丸(CDDP)、丙戊酸钠(VPA)单独治疗和联合治疗,通过水迷宫和八臂迷宫实验考察联合治疗对大鼠行为学、学习记忆能力、空间参照记忆能力的影响,尼氏染色法考察对大鼠神经元损伤的影响,UPLC-MS/MS法考察CDDP对VPA血药浓度的影响,酶联免疫吸附实验(ELISA)考察对大鼠脑组织和血清中CRP、IL-6、TNF-α水平的影响,实时荧光定量PCR和Western Blot法考察对凋亡因子Caspase3、Caspase8基因和蛋白的影响,从而验证VPA联合CDDP对癫痫大鼠是否具有更好的抗痫作用并为临床用药提供一定的理论依据。方法1.将SD雄性大鼠采用脑立体定位技术向海马内注入红藻氨酸(KA)(生理盐水组注入一定量的生理盐水)建立癫痫模型,根据Racine等级筛选出点燃成功的模型。之后随机分为模型组(Model)、生理盐水组(Saline)、丙戊酸钠组(VPA)、复方丹参滴丸组(CDDP)、丙戊酸钠联合复方丹参滴丸组(VPA+CDDP),每组8只大鼠。模型组和生理盐水组分别灌胃给予一定剂量的生理盐水,其余各组给予相应的药物,分别于给药30d、60d后通过Morris水迷宫和八臂迷宫考察对癫痫大鼠行为学、学习记忆能力、空间参照记忆能力的影响。2.在灌胃60d后的大鼠中随机选取4只,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后用4%多聚甲醛和生理盐水心脏灌注至四肢僵直,快速断头取脑并用多聚甲醛固定,通过尼氏染色和神经元计数观察大鼠海马及CA3区神经元损伤情况。3.将癫痫大鼠随机分为VPA组和VPA+CDDP组,每组5只。VPA+CDDP组以CDDP连续灌胃给药7天后,第8天时两组大鼠再分别灌胃给予VPA,在不同时间点进行眼眶采血,通过UPLC-MS/MS法测定VPA血药浓度,DAS 3.0软件绘制药时曲线,研究CDDP对癫痫大鼠体内VPA血药浓度的影响。4.在灌胃60d后的每组大鼠中随机选取5只,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,采集大鼠血液和脑组织,分离出血清以及处理得到脑组织匀浆后用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠脑组织和血清中CRP、IL-6、TNF-α的含量。5.在灌胃60d后的每组大鼠中随机选取6只,腹腔注射10%水合氯醛,断头取脑,快速剥离出海马,处理后通过实时荧光定量PCR和Western Blot法测定大鼠凋亡因子Caspase3、Caspase8的基因和蛋白的表达情况。结果1.定位航行实验中随着训练时间的增加,各组大鼠逃避潜伏期均有所下降,且其余各组与同期模型组大鼠逃避潜伏期相比均明显减少(P0.01)。30d时,与单用VPA相比VPA+CDDP组逃避潜伏期有所减少但无统计学意义(P0.05);60d时与单用VPA组相比VPA+CDDP组所用时间明显减少(P0.05,P0.01);空间探索实验中,与模型组比较其余各组穿越平台次数均有不同程度的增多,且60d时VPA+CDDP组较单用VPA组显著增多(P0.01)。八臂迷宫中,其余各组的参考记忆错误次数、工作记忆错误次数和吃完食物总时间均低于模型组,且60d时VPA+CDDP各项指标较单用VPA组均显著降低(P0.05)。2.尼氏染色中与模型组相比,各组大鼠海马CA3区神经元细胞数目均有所增多,且VPA+CDDP组与单用VPA组相比显著增多(P0.05)。3.与单用VPA组相比,联合组大鼠药动学参数中曲线下面积(AUC_((0-8h))和AUC_((0-∞)))、峰浓度(C_(max))、达峰时间(T_(max))均显著性提高(P0.01,P0.05),清除率(CL_(Z/F))显著降低(P0.05)。半衰期(T_(1/2z))、表观分布容积(V_(z/F))均有不同程度的提高。4.与模型组相比,其余各组大鼠脑组织和血清中CRP、IL-6、TNF-α的含量均显著降低(P0.01)。VPA+CDDP组较单用VPA组脑组织中CRP含量显著降低(P0.01),IL-6和TNF-α水平VPA+CDDP组较VPA组均有所降低但无统计学意义(P0.05)。5.与模型组相比,VPA+CDDP和对照组Caspase3基因表达量均显著减少(P0.01),与单用VPA相比VPA+CDDP组Caspase3基因表达量显著减少(P0.05);与对照组相比其余各组Caspase8的基因表达量均显著增加(P0.01,P0.05),而VPA+CDDP组与单用VPA组相比无统计学意义(P0.05)。6.与模型组相比,其余各组Caspase3、Caspase8蛋白的表达量显著减少(P0.01);且与单用VPA相比,VPA+CDDP组Caspase3和Caspase8蛋白表达量均显著减少(P0.01)。结论丙戊酸钠联合复方丹参滴丸可增加丙戊酸钠在癫痫大鼠体内的分布,提高其血药浓度;而且可以更好的改善癫痫大鼠的学习记忆能力和空间参照记忆能力,减少神经元受损,其机制可能是通过减少脑内CRP等炎症因子而调节炎症反应或者是通过调控凋亡因子Caspase3、Caspase8从而减少细胞凋亡。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

VPA VPA+CDDP图 2-1 各组大鼠在 Morris 水迷宫中搜索平台策略图2.6.2 30d 时各组大鼠学习记忆能力的变化2.6.2.1 30d 大鼠定位航行实验所用时间比较各组大鼠每天定位航行实验所用时间如表 2-1，图 2-2，与模型组相比，生理盐水组和 VPA+CDDP 组大鼠所用时间均明显缩短（P<0.01，P<0.05）；且随着训练时间的延长，各组大鼠所用时间均有所减少，其余各组与 VPA+CDDP 组和 VPA 组相比逐渐呈现显著性差异（P<0.01）。虽然与单用 VPA 组比较，VPA+CDDP 组大鼠所用时间并无统计学差异（P>0.05），但是 VPA+CDDP 组所用时间相对 VPA 组有所减少。

州大学硕士研究生学位论文 丙戊酸钠联合复方丹参滴丸对癫痫大鼠抗痫作用的.3 实验结果染色结果如图 3-1，3-2，由图可知，生理盐水组较其余组尼氏小体分布正较丰富，神经元排列整齐，海马组织结构完整，而其它组海马和 CA3 区均了不同程度的神经元丢失的情况。其中，模型组海马和 CA3 区神经元丢失，数目严重减少，尼氏小体严重减少甚至消失。而与模型组相比，各组大鼠 CA3 区神经元细胞数目均有所增多，联合组海马 CA3 区神经元细胞有显著（P<0.01）；而 VPA+CDDP 组与单用 VPA 组相比明显增多，且具有统计异（P<0.05）。

21图 3-2 各组大鼠 CA3 区尼氏染色图片（x200）图 3-3 各组大鼠海马 CA3 区神经元数目注：与生理盐水组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.05，与丙戊酸钠组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.05。102030405060708090100110120▲▲▲▲▲****△△△△△△numberofsurvingneuronsSaline Model CDDPVPA VPA+CDDP△△***▲▲

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1 张景梅;梁洪s

本文编号：2771785