防治毛细胞损伤的中药提取物的筛选及其纳米制剂的研究

发布时间：2020-07-27 13:00

【摘要】：随着当代医疗技术的飞速发展,人们对耳部相关的疾病有了越来越深入的研究,因此防治毛细胞损伤的研究正迎来一个新的春天。目前治疗耳聋的方法有使用药物治疗,基因治疗,干细胞疗法等。我国天然药物资源蕴藏丰富,中药是众多药物库中的一个重要构成,它在防治药源性耳聋方面的研究也日渐增加。基于纳米制剂可以提高或改善药物的生物利用度,因此在近几年引起了研究者们的关注。在现代的临床用药中已表明氨基糖苷类是非常有效的抗菌剂;顺铂是一种化学治疗剂,常用于治疗癌症(如肺癌,前列腺癌等),但众所周知的是,它们的使用会引起耳毒性,极大地影响病人的生活质量。因此,在能够保持顺铂或庆大霉素药效的同时,降低它们的耳毒性是目前研究人员面临的重大挑战,本研究对细胞和斑马鱼分别进行庆大霉素,顺铂的造模,从224种中药提取物中筛选出有效的组分,并初步构建其纳米制剂,为进一步发现能够预防耳毒性药物及制剂的研发奠定基础。本研究以小鼠耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞为模型,经过实验考察,利用庆大霉素或顺铂造模条件分别为10 mM和40μM作用细胞24 h,并且选择40μM EDA作为庆大霉素造模的阳性药,1 mM NAC作为顺铂造模时的阳性药。筛选了224种中药提取物,实验发现了有13种中药提取物既有庆大霉素,又有由顺铂诱导的HEI-OC1细胞损伤的预防作用,使用有效提取物进行预孵育后,细胞存活率有明显提高。以野生型AB系斑马鱼幼鱼为模型,经过实验考察,利用庆大霉素和顺铂造模条件分别为100μM和1 mM分别作用细胞1 h和4 h,并且选择80μg/mL EDA作为庆大霉素造模的阳性药,40μg/mL NAC作为顺铂造模时的阳性药。实验发现有2种中药提取物既有庆大霉素,又有顺铂诱导的毛细胞损伤的预防作用,使用有效提取物进行预孵育后,斑马鱼神经丘的毛细胞损伤程度有明显降低。进一步探讨了筛选出来的有效提取物是否会影响庆大霉素的抑菌疗效和顺铂的抗肺癌活性,以及是否会促进毛细胞的再生。采用MTT法测定非小细胞肺癌A549细胞的存活率,纸片法测定庆大霉素的抑菌疗效,Brdu标记法考察斑马鱼毛细胞的再生情况。结果发现,13种有效提取物既不会影响顺铂的抗癌作用,也不会影响庆大霉素的抑菌疗效,并且有效提取物对毛细胞预防作用的机制是使毛细胞免受到庆大霉素的损害,而不是促进毛细胞的快速再生。最后,初步研究制备包载有效提取物的壳聚糖纳米粒,并考察了包载尼罗红的壳聚糖纳米粒在斑马鱼幼鱼中的摄取情况,斑马鱼摄取试验表明在装载尼罗红的壳聚糖纳米粒与幼鱼作用1小时后,可明显看到纳米粒能够被斑马鱼大量摄取,药效实验表明包载有效提取物壳聚糖纳米粒对庆大霉素或顺铂诱导的HEI-OC1细胞和斑马鱼损伤均具有预防作用。综上所述,本研究结果表明,以庆大霉素或顺铂所致的HEI-OC1细胞和斑马鱼幼鱼毛细胞损伤模型,将有望成为新型大规模筛选出预防耳毒性药物的平台。筛选出来的两种提取物对庆大霉素或顺铂所致的耳毒性具有预防和治疗作用,并且包载有效提取物的壳聚糖纳米制剂在防治耳聋领域具有一定的潜在应用价值。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R283.6
【图文】：

庆大霉素,细胞毒性,细胞的

学差异（P<0.001），因此选择的造模条件分别为 10 mM 庆大霉素或 40 μM 的顺铂孵育 24 h。图2-1 庆大霉素（A）和顺铂（B）对HEI-OC1细胞毒性Fig. 2-1 Cytotoxicity of gentamicin (A), CDDP (B) when incubated with HEI-OC1 Cells asdetermined by MTT assay. *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001 vs. control group. Results wereshown as mean±SD (n = 6) .2.3.2 阳性药的考察使用不同浓度的 EDA（0，5，10，20，40，80 μM）作用 24 小时后，采用MTT 法测出其对 HEI-OC1 细胞的毒性，发现在 0-80 μM 浓度范围内的 EDA（EDA）对 HEI-OC1 细胞的存活率无影响

测定法,细胞毒性

广东药科大学硕士研究生学位论文用不同浓度的 EDA（0，10，20，40μM）预处理 HEI-OC1 细胞 1 小时后终浓度为 10 mM 的庆大霉素继续孵育 24 小时，结果显示加 20，40 与未加的相比，细胞存活率显著性增加，且有统计学意义，说明 EDA素引起的 HEI-OC1 细胞损伤具有预防作用，见图 2-2C。先用不同浓度0，0.5，1 mM）预处理 HEI-OC1 细胞 1 小时后，再加入终浓度为 40 继续孵育 24 小时，发现加入 0.5，1mMEDA 的与未加的相比，细胞存性增加，且有统计学意义，说明 NAC 对顺铂引起的 HEI-OC1 细胞损伤作用，见图 2-2D。当 EDA 和 NAC 的浓度分别大于 40 μM 和 1 mM 时始死亡，因此选择 EDA（作为庆大霉素造模的阳性药）和 NAC（作为时的阳性药）的最佳保护浓度分别为 40 μM 和 1 mM。

毛细胞,庆大霉素,斑马鱼,侧线

结果也提示如此。给药组与正常对照组相比，庆大霉素的浓度为 100 μM 时,毛细胞数量下降约为正常对照组的 50%，具有统计学差异（P<0.001）。图3-1 庆大霉素损伤5 dpf的斑马鱼侧线毛细胞DASPEI染色(A)及计数(B), *P < 0.05, **P<0.01,***P <0.001 vs. 对照组。Fig. 3-1 DASPEI staining (A) and counting (B) of hair cells in zebrafish lateral lineafter gentamicin injury. *P < 0.05, **P <0.01, ***P <0.001 vs. control group.

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