汉黄芩素调控P53核转位干预结直肠癌的作用机制

发布时间：2020-07-28 13:26

【摘要】：目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)作为当今世界发病率第三,致死率第四的恶性肿瘤,在2012年世界范围内的发病数达到了约136万例,而死亡数接近一半。虽然死亡率每年都会有所降低,但是发病率却仍持续逐年上升,因此,化学预防是降低结直肠癌发病的重心。汉黄芩素是一类提取于唇形科植物黄芩根的黄酮类化合物,据文献报道,其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化以及抗菌的作用。体外研究表明汉黄芩素能够抑制肿瘤细胞的增殖和生长,并且可以诱导肿瘤细胞凋亡。P53是目前已知的与肿瘤发生发展相关性最高的抑癌基因之一,其主要的功能是通过引起细胞周期阻滞、DNA修复以及诱导异常细胞凋亡来维持基因组和细胞的稳态,从而对肿瘤的发生和发展起到抑制作用。P53的亚细胞定位对肿瘤细胞的命运会产生不同的影响,当P53定位于细胞质中时会抑制肿瘤细胞的自噬,而当P53定位于细胞核中时,会促进细胞产生自噬。基于目前的研究现状,本文将利用AOM/DSS化学诱导小鼠结肠癌模型来评价汉黄芩素对结直肠癌的化学预防作用,并且结合体外细胞模型探索其抑制结直肠癌发生发展的作用机制。方法:1.汉黄芩素抑制结直肠癌细胞增殖,并且调节自噬与凋亡采用结肠癌细胞HCT116与HT29细胞作为体外研究模型,经过不同浓度的汉黄芩素(0-8Oμ M)处理72小时之后采用MTT法检测汉黄芩素对两种细胞的增殖抑制能力,根据MTT得到的IC50确定出后续实验的给药剂量,继而采用平板克隆实验来验证汉黄芩素对这两种细胞的克隆形成能力。然后通过蛋白免疫印迹法(Western blot)和流式细胞术(Flow cytometry)检测了汉黄芩素对HCT116与HT29结肠癌细胞自噬和凋亡的影响。2.汉黄零素调节结直肠癌细胞内的活性氧水平采用汉黄芩素处理HCT116与HT29细胞2小时之后收取细胞样品,按照活性氧检测试剂盒的操作步骤对细胞内的活性氧进行荧光染色标记之后采用流式细胞仪检测细胞中活性氧的改变情况。3.汉黄芩素调节结直肠癌细胞内质网应激和DNA损伤由MTT法确定出后续实验的给药浓度,然后用所确定浓度的汉黄芩素处理HCT116与HT29结肠癌细胞72小时,提取总蛋白,用Western blot技术来检测汉黄芩素对这两种细胞的内质网应激和DNA损伤通路的影响,并采用Real-time PCR检测内质网应激通路中下游基因DDIT3和XBPI的表达水平。最后采用单细胞凝胶电泳实验(彗星拖尾实验)来观察汉黄芩素对HCT116与HT29结肠癌细胞DNA损伤的影响。4.汉黄芩素对结肠癌细胞P53核转位的影响药物处理HCT116与HT29结肠癌细胞后分别提取总蛋白以及胞浆胞核蛋白,采用Western blot技术检测药物对总蛋白中P53核转位相关的磷酸化P53蛋白水平,然后再分别检测胞浆胞核蛋白中的磷酸化P53蛋白水平。最后,采用细胞免疫荧光实验来观察汉黄芩素对HCT116与HT29结肠癌细胞P53核转位相关的磷酸化蛋白表达水平的影响。5.汉黄芩素对AOM/DSS化学诱导结直肠癌动物模型的预防作用研究本章节采用AOM/DSS诱导的炎症性结直肠癌的动物模型,汉黄芩素给药处理20周,考察汉黄芩素对结直肠癌形成和发展过程中的化学预防作用。造模期间定期记录动物体重,观察动物状态,以便评估汉黄芩素对动物是否有毒性。在实验终点时,统计每组小鼠的肿瘤发生率和结肠长度,采用Western blot法检测自噬、凋亡、内质网应激和DNA损伤相关蛋白的表达水平。6.统计分析数据分析采用SPSS 17.0统计软件来进行,采用One way ANOVA来比较多个处理组之间的均数,P0.05表示处理组之间具有显著性差异。采用GraphPad 5.0数据分析软件作图,数据结果以Mean 土 SD表示。结果:1.汉黄岑素显著抑制HCT116和HT29结肠癌细胞的增殖,并且对这两种结肠癌细胞的自噬和凋亡产生不同的作用经汉黄芩素给药72小时之后,汉黄芩素在这两种细胞上的IC50分别为70.14 14μM和117.9 μM,10μ M的汉黄芩素即可对HCT116和HT29结肠癌细胞产生明显的抑制作用。经过平板克隆实验我们观察到汉黄芩素对HCT116和HT29结肠癌细胞克隆形成能力均有明显的抑制作用。与此同时,汉黄芩素抑制了 HCT116细胞的自噬,诱导其产生凋亡。相反地,汉黄芩素处理72小时能够显著地促进HT29细胞的自噬,但是汉黄芩素处理24小时之后却能够抑制到HT29细胞的凋亡。2.汉黄芩素刺激HCT116细胞内活性氧的产生,而抑制HT29细胞内活性氧的释放汉黄芩素处理HCT116和HT29结肠癌细胞2小时之后收取细胞样品,经过流式细胞仪检测后发现,汉黄芩素能诱导HCT116细胞内活性氧的产生,经过统计后发现,相对于对照组其细胞内活性氧染料荧光的百分比显著增加,而经过还原剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后,HCT116细胞内的活性氧水平显著降低;然而在HT29细胞中,汉黄芩素处理两个小时之后抑制了细胞内活性氧的产生。3.汉黄芩素能够促进HCT116内质网应激和DNA损伤,抑制HT29内质网应激和DNA损伤HCT116和HT29结肠癌细胞给予汉黄芩素处理72小时之后检测药物对这两种细胞内质网应激和DNA损伤的影响水平。结果显示,汉黄芩素能够诱导HCT116细胞产生内质网应激,显著上调该通路相关蛋白以及下游靶基因DDIT3和XBP1表达水平;汉黄芩素作用于HT29后抑制其内质网应激作用,显著下调该通路相关蛋白表达量,以及其下游靶基因DDIT3和XBP1的表达水平。与此同时,汉黄芩素能够诱导HCCT116细胞产生DNA损伤,激活该通路相关蛋白,单细胞凝胶电泳实验也显示出细胞出现较长的拖尾现象;汉黄芩素作用于HT29之后抑制了其DNA损伤作用,与该通路相关蛋白表达量有所下调,单细胞凝胶电泳实验未观察到细胞出现拖尾现象。4.汉黄等素促进了 p53在HCT116细胞中的胞浆定位,促进了 p53在HT29细胞中的胞核定位。在HCT116细胞的总蛋白中,汉黄芩素作用后可以显著增加p-p53(ser315)和p-p53(ser376)的水平,而且细胞免疫荧光实验结果表明,汉黄芩素可以促进p-p53(ser15)在细胞质中积累,增加p53在HCT116细胞中的胞浆定位。在HT29细胞的总蛋白中,汉黄岑1素降低p-p53(ser315)和p-p53(ser376)的水平,而且细胞免疫荧光实验的结果显示,汉黄芩素可以促进p-p53(ser15)在细胞核中的积累,促使P53在HT29细胞中的胞核定位。5.汉黄芩素体内化学预防结直肠癌作用的机制在由AOM/DSS诱导的炎症性结直肠癌动物模型中,汉黄芩素能够显著地降低结直肠癌的发生率。在持续二十周的给药之后,各组小鼠之间的体重并未出现明显的差异,并且在给药之后由炎症引起的结肠缩短也得到了很好地恢复。此外,给药之后动物体内的内质网应激和DNA损伤均上调,并且自噬水平显著降低,凋亡细胞显著升高。结论:本课题采用体外结肠癌细胞和AOM/DSS诱导的炎症性结直肠癌动物模型来探讨了汉黄芩素对结直肠癌预防的作用机制。研究发现汉黄芩素能够影响ROS产生,调控内质网应激和DNA损伤通路,进而对p53的核转位功能产生影响,最终通过凋亡或自噬通路诱导细胞死亡。在HCT116细胞中,汉黄芩素能够促使p53在细胞质中定位,进而对自噬产生抑制作用;而在HT29细胞中汉黄芩素能够诱导p53定位于胞核,进而对自噬产生促进作用。因此,本研究为汉黄芩素对结直肠癌的化学预防提供了一个新的理论依据。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

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龄的升高而增加。在大部分的发达国家之中，结直肠癌的发病中位年龄约为７０岁。逡逑结直肠癌的发病率在我国虽然不高，但是其呈现出一种上升的趋势？。全球每年约有逡逑８０万人死于结直肠癌，而我国的结直肠癌发病数和死亡数均占全球第一（图１．１）。逡逑我国人口老龄化情况日益加重，并且由工业化进程导致的环境污染使得结直肠癌的发逡逑生率无论是在农村还是城市均逐年升高，阮丽琴等人通过对２３８４例结直肠癌患者的逡逑临床资料统计分析后发现在不同的年龄组中男性的发病率均高于女性；在青年患者组＃逡逑中，男女患病比例为１．６７：１，随着年龄的增长，该比例有所下降，在老年患者组中的逡逑发病比例降低为１．２９：ｌｔ２５］。此外，从地域的角度来看，在我国东部沿海发达地区结直逡逑肠癌的发病率明显高于内地，例如上海地区的结直肠癌发病率已经跃居到了第二位，逡逑这提示我们结直肠癌的发生或许与西式化的饮食以及生活方式的改变也有一定的关＿逡逑系。结直肠癌的高发不仅会对患者的生理和心理造成极大的痛苦，更会对社会的平稳逡逑健康发展产生严重的阻碍作用，因此如何降低结直肠癌的发生率以及提高治疗效率己１逡逑经成为全球范围性的关注问题。逡逑１．２结直肠癌的发病机理逡逑有研宄表明

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BSA标准曲线的制作以及蛋白样品定量流程图

汉黄芩素调控P53核转位干预结直肠癌的作用机制

图２．邋２邋ＢＳＡ标准标曲

【参考文献】