荷叶离褶伞菌多糖的结构鉴定及生物活性研究

发布时间：2020-07-28 12:28

【摘要】：食药两用的荷叶离褶伞菌(Lyophyllum decastes(Fr.:Fr.)Sing)为白蘑科离褶伞属真菌,研究发现从荷叶离褶伞菌中提取出的多糖可参与多种生物活动。目前对荷叶离褶伞菌的研究主要集中在提取出的粗多糖体外刺激细胞参与免疫反应,对荷叶离褶伞菌多糖的精细结构暂无相关报道,同时缺乏系统性地研究荷叶离褶伞菌多糖体内外刺激细胞参与免疫反应的作用机制。本研究从采自四川省小金县的荷叶离褶伞菌中提取得到较高纯度的多糖,并对其精细结构进行相关性研究,同时对提取出的荷叶离褶伞菌多糖体内外生物学活性进行系统性分析,希望能进一步了解具高效生物学活性的荷叶离褶伞菌多糖结构及其免疫作用机制。本论文主要研究结果如下:(1)采用转录间隔区ITS序列分析法和形态比对法鉴定荷叶离褶伞菌的分类学地位。确定该菌种为荷叶离褶伞菌(Lyophyllum decastes(Fr.:Fr.)Sing)。(2)以荷叶离褶伞菌子实体作为实验材料,通过热水浸提法、醇沉法、DEAE cellulose-52色谱和DEAE-FF凝胶色谱层析法、超净水透析法分离纯化多糖,获得荷叶离褶伞多糖(LDS-1)。最后,通过高效凝胶渗透色谱法(HPLC-RID)测得荷叶离褶伞多糖(LDS-1)是重均分子量(Mw)为8681 Da的均一多糖。(3)利用FT-IR、HPLC-RID、~1H-NMR、~(13)C-NMR、HMQC、HMBC、~1H-~1H COSY、GC-MS分析LDS-1的精细结构,荷叶离褶伞多糖的糖单元结构是以比例为2:1的葡萄糖残基和半乳糖残基组成,并以1,4-α-葡萄糖残基为主链,其中一个葡萄糖残基的6-O位上连接支链,支链由两个β-半乳糖残基组成,以1,6-连接的方式结合,其中一个半乳糖残基的C1位上连接主链,6-O位上连接另一个半乳糖残基。(4)检测LDS-1在所设的浓度范围内对T细胞、B细胞和RAW264.7细胞的细胞学活性的影响,结果显示LDS-1对免疫细胞的增殖具有显著促进作用。检测LDS-1在所设的浓度范围内对细胞分泌免疫因子的影响,结果显示LDS-1促进IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、TNF-α、TNF1-β、IL-2的分泌,其中IgE的最高分泌率为46.22%。通过检测RAW264.7细胞吞噬中性红和荧光微球,结果显示在所设的浓度范围内测得LDS-1促进RAW264.7吞噬,其中中性红的吞噬率高达60.67%。检测LDS-1在所设的浓度范围内对CT26.WT、MFC、L929、S180肿瘤细胞增殖的影响,结果显示LDS-1能抑制各肿瘤细胞的增殖,抑制率最高可达45.01%。建立S180肿瘤小鼠模型,测得LDS-1的肿瘤抑制率为54.32%。(5)通过对小鼠S180肿瘤组织转录组分析,发现LDS-1在MAPK途径中主要通过下调creb、cd14、traf6、ikk、nfκb等基因,减少DNA的表达量,抑制肿瘤细胞增殖和分化、抗老化。LDS-1在Ras信号通路中,下调rassf1、nore1、mst1、pak、rac、ikk、nfκb等基因,负调控细胞周期,抑制肿瘤细胞的侵染和转移。在PI3K-Akt信号通路中,下调基因egf、ras、raf1、pkcs、creb、ikk、nfκb介导肿瘤细胞DNA的修复,降低细胞对葡萄糖的摄取量,间接调控肿瘤细胞的存活量。LDS-1在细胞循环、Wnt信号通路、细胞核区域中通过上调p15ink4b、wnt、fzd、c/ebpα、pdgf、IkBα等基因,负调控肿瘤细胞细胞周期,抑制肿瘤细胞逃避凋亡和分化。综上结果,可知荷叶离褶伞菌多糖(LDS-1)为新颖性多糖,具有促免疫抗肿瘤的作用,为其食药应用提供一定的理论依据。
【学位授予单位】：西华师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285.5
【图文】：

荷叶离褶伞菌的rDNA-ITSPCR产物

野生型荷叶离褶伞菌的ITS序列

基于rDNA-ITS序列构建的野生荷叶离褶伞菌系统发育树

【参考文献】

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本文编号：2772881