白花地胆草单体EM-12通过激活内质网应激介导的内源性凋亡通路诱导卵巢癌细胞凋亡

发布时间：2020-07-29 10:42

【摘要】：研究目的:卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤,死亡率在妇科肿瘤中位居首位。顺铂和紫杉醇是卵巢癌的治疗中最常用的化疗药物,最初治疗时都会有比较好的疗效,但是只有少部分的患者可被治愈,超过75%的病人仍会复发。复发的患者会从化疗敏感转化为化疗耐受,导致治疗效果不佳。所以,迫切需要寻找新的药物用于卵巢癌的临床治疗。目前,中药在抗肿瘤药物研究领域受到许多关注。有研究者从广东民间常用的消肿止痛、抗肿瘤中药中选出25种中药,使用不同方法进行提取纯化,发现重楼和地胆草的醇提物对鼻咽癌CNE1细胞的增殖抑制效果最佳。白花地胆草(Elephantopus mollis H.B.K.)为菊科地胆草属植物,是我国长江以南地区最为常用的民间药物。本课题组发现从白花地胆草中分离得到的倍半萜内酯类单体EM-12对肿瘤细胞具有良好的增殖抑制效果,然而关于它的药理学分子机制却是未知的。所以,我们进一步探讨EM-12对人卵巢癌细胞的促凋亡作用及其分子机制。研究方法:MTT实验与克隆形成实验检测细胞增殖能力;台酚蓝染色法检测细胞活性;RNA-Seq检测转录组的变化;RT-qPCR检测相关基因的mRNA水平;免疫印迹检测相关蛋白的水平;透射电镜检测亚细胞超微结构;流式细胞术检测细胞凋亡水平;分子克隆构建质粒;脂质体转染建立瞬时表达或敲低细胞株;分子对接预测药物与蛋白的相互作用;免疫共沉淀技术检测蛋白之间的结合;体外ATP酶活性测定实验检测ATP酶活性。研究结果:基于本课题组前期的研究结果,我们发现EM-12对鼻咽癌细胞具有较强的增殖抑制作用。因此我们推测EM-12对于卵巢癌细胞也具有良好的增殖抑制效果。通过MTT法检测EM-12对于卵巢癌细胞的增殖抑制效果,我们发现EM-12可以显著的抑制卵巢癌细胞的增殖,而对于正常卵巢上皮细胞增殖抑制效果不显著。我们以A2780细胞为研究对象,进一步研究EM-12抑制卵巢癌细胞增殖的分子机制。通过RNA-Seq测序与GO功能分析,我们发现EM-12可以显著激活内质网应激介导的内源性凋亡通路。通过RT-qPCR与免疫印迹,我们发现未折叠蛋白反应相关mRNA与蛋白水平被EM-12上调,且相关蛋白发生磷酸化激活;通过透射电镜检测细胞的内质网形态,我们发现EM-12处理细胞后使得内质网发生膨胀。由此证明,EM-12的确诱导内质网应激。通过免疫印迹,我们发现EM-12处理细胞后BCL-2蛋白水平下调,总的Caspase-9、Caspase-3蛋白水平减少,并且PARP出现切割。这说明EM-12的确可以诱导细胞凋亡。进一步地,敲低CHOP可以逆转EM-12所诱导的细胞凋亡。由此证明,EM-12通过诱导内质网应激介导细胞凋亡。接下来,我们探讨EM-12诱导内质网应激的分子机制。BiP是热休克蛋白HSP70家族的成员,它可以依靠NBD结构域的ATP酶活性来发挥其分子伴侣的功能辅助蛋白质的折叠;并且,BiP可以通过NBD结构域与IRE1α、PERK、ATF6结合,抑制未折叠蛋白反应通路的激活。所以,BiP在内质网应激的调控中具有至关重要的作用。那么,我们猜测EM-12可能通过靶向BiP的NBD结构域诱导内质网应激。所以,通过分子对接研究EM-12与BiP的相互作用,我们发现EM-12可以与BiP的NBD结构域相互结合;通过体外ATP酶活性的测定实验发现EM-12的确可以抑制BiP的ATP酶活性;而通过免疫共沉淀实验检测,我们发现EM-12可以阻断BiP与IRE1α、PERK的结合;由此证明,EM-12的确可以竞争性结合BiP的NBD结构域,并且抑制其ATP酶活性,从而诱导内质网应激。既然,EM-12可以通过靶向BiP的NBD结构域诱导内质网应激从而介导内源性凋亡导致卵巢癌细胞发生凋亡。那么,EM-12对于其他癌种的肿瘤细胞是否也具有相同的药理作用?通过免疫印迹检测未折叠蛋白反应相关蛋白水平与流式细胞术检测细胞凋亡,我们发现EM-12对于肝癌、鼻咽癌、乳腺癌也具有相同的药理作用。同时,我们发现EM-12对于紫杉醇耐药的卵巢癌细胞也具有相同的促凋亡作用。结论:(1)EM-12可以通过激活内质网应激介导的内源性凋亡通路诱导卵巢癌细胞凋亡。同时,EM-12对于正常卵巢上皮细胞的毒性较小。(2)EM-12通过靶向BiP的NBD结构域诱导内质网应激。(3)EM-12可以通过激活内质网应激介导的内源性凋亡通路诱导肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、及对紫杉醇耐药的卵巢癌细胞发生细胞凋亡。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

未折叠蛋白

究 EM-12 对人卵巢癌细胞的促凋亡作用及其分子机制。为 EM-12 将来应用于床治疗奠定实验基础。质网应激与未折叠蛋白反应质网（endoplasmic reticulum）是真核细胞中最大细胞器[24]。它主要的功能是的合成、加工、折叠、运输，与分泌[25]。饥饿、缺氧、基因突变、钙离子紊的超负荷等因素可以引起大量未折叠或者错误折叠的蛋白在内质网中堆积，导网稳态失衡及功能发生紊乱，这一过程被称为内质网应激（ER Stress，ERS）了存活，进化出一种针对内质网应激的反应，是内质网应激发生时细胞内的最认为是一种细胞保护机制，其目的在于恢复内质网的稳态，减轻内质网应激，胞生存[27]。内质网应激反应（ER Stress Response）既要增加内质网对蛋白质和降解能力，又要降低进入内质网中的蛋白质数量来减轻内质网的负担。这些未折叠蛋白反应（unfolding protein response, UPR）来完成[28]。

应激,调节作用,未折叠蛋白,蛋白

暨南大学硕士学位论文侣参与内质网中蛋白质的折叠与组装，帮助未折叠及错误折叠的蛋白质正确的折叠与组装，或者使错误折叠及未折叠的蛋白进入内质网相关蛋白降解途径（ER-associated proteindegradation，ERAD），其在调节未折叠蛋白反应上起着重要作用[29]。如图 2 所示，在细胞处在未发生内质网应激或生理水平内质网应激状态下，BiP 通过它的 NBD 结构域与IRE1α、PERK、ATF6 结合，抑制 IRE1α、PERK、ATF6 的激活；当细胞中内质网应激水平上升时，内质网中未折叠蛋白与错误折叠蛋白的累积，导致 BiP 从 IRE1α、PERK、ATF6解离下来，主动与未折叠蛋白发生结合，帮助它们进行正确折叠或者帮助它们进入内质网相关蛋白降解途径。解离后，三种内质网膜蛋白 IRE1α、PERK、ATF6 激活，启动未折叠蛋白反应[30]。未折叠蛋白反应可以通过以下 3 条通路激活：

未折叠蛋白,细胞存活

图 3：未折叠蛋白反应与细胞存活（摘自：Guohui Wang, Zeng-Quan Yang, Kezhong Zhang, et al. Am J Transl Res. 2010）1.4 内质网应激与细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的细胞自主、有序的死亡，它可以维持内环境的稳定[51]。其特征是细胞形态由正常形态开始变圆、变小，细胞核凝集破碎，胞质皱缩内陷，从而形成大量的凋亡小体[52]。细胞凋亡途径主要有三种：死亡受体凋亡途径、线粒体凋亡途径以及内质网应激介导的内源性凋亡途径。当细胞内质网应激水平上升时，未折叠蛋白反应致力于恢复内质网稳态，减轻内质网应激。如果，细胞处于过度的内质网应激状态下，凋亡信号将被启动。内质网应激介导的凋亡有多种途径，如 Caspase 依赖途径、CHOP 依赖途径等[53;54]。CHOP 依赖的凋亡途径是内质网应激导致凋亡的主要通路[55;56]。当细胞发生强烈的内质网应激时，内质网应激可以通过激活未折叠蛋白反应，诱导 CHOP 的表达，最终诱导细胞凋亡。

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