基于网络分析探索大戟甘草药对缓解肝癌腹水的作用机制

发布时间：2020-07-30 01:57

【摘要】：目的:基于网络药理学研究策略,探讨“大戟-甘草”药对配伍对H22肝癌腹水小鼠模型的影响及其作用机制,为中药“十八反”“藻戟遂芫俱战草”中“大戟反甘草”的配伍禁忌内涵提供实验依据。方法:采用H22肝癌腹水小鼠的动物模型,研究“大戟-甘草”药对对模型小鼠的影响及其作用机制。1.通过药效学结果筛选“大戟-甘草”药对的协同组及拮抗组:120只雄性昆明小鼠随机分为空白、模型、大戟与甘草不同配比(1:0.5、1:1、1:2和1:4)、大戟单煎和甘草单煎共8组,每组15只。小鼠适应性饲养3d后,除空白组外,其他组小鼠均腹腔接种制备肝癌腹水模型。取腹水饱满的H22肝癌瘤源鼠于超净工作台,脱颈椎处死,固定于蜡板上,用碘酒及酒精消毒鼠腹,抽取腹水;将抽取的活体腹水细胞用生理盐水按1:3稀释,调整浓度(2×106个/mL瘤细胞),使存活率在95%以上;消毒小鼠腹部,用无菌注射器取0.3 mL稀释的腹水,分别注入待造模小鼠腹腔,造模完成。造模当天下午,各给药组开始灌胃给药。大戟-甘草1:0.5组、1:1组、1:2组、1:4组分别灌胃大戟-甘草合煎液0.579、0.772、1.158、1.931 g/Kg/d;大戟组灌胃大戟煎液0.386 g/Kg/d;甘草组灌胃甘草煎液1.546 g/Kg/d。在该给药剂量下,大戟给药量为人临床等效剂量的3 g。空白组与模型组每天给予等量的生理盐水,连续给药12天。7天后仍然没有明显腹围增加的小鼠,即判定为造模失败,去除。造模成功率为80%。第12天早上给药,6小时后最后一次检测各小鼠体重、腹围、腹水量后摘除眼球取血,于4 ℃低温离心机中,3000 rpm,离心15 min,分离血清,-80 ℃储存用作血液生化指标检测:抽取各小鼠腹水,记录其腹水量,作为药效学指标;于冰上取其腹膜组织于Trizol中,置于干冰中保存,用于全基因组表达谱检测;并取其肝肾组织,一部分肝肾组织置于4%多聚甲醛中固定,用于病理学检测,另一部分置于-80 ℃保存,用于后期实验验证。并以相同实验方法进行第二批动物实验,验证药效学筛选结果。2.通过全基因组表达谱检测与网络药理学分析,探索“大戟-甘草”药对缓解肝癌腹水的机制。通过全基因组表达谱检测结果筛选出:(1)与肝癌腹水疾病发生相关的基因集(模型组VS空白组);(2)与大戟单味药缓解肝癌腹水药效相关的基因集(大戟组VS模型组);(3)加入甘草后,促进大戟缓解肝癌腹水药效相关的基因集(协同组VS大戟组);(4)加入甘草后,拮抗大戟缓解肝癌腹水药效相关的基因集(拮抗组VS大戟组)。基于上述四组基因间的相互作用信息,建立疾病-药物多层次相互作用网络,通过网络拓扑特征计算和各种功能通路富集分析,得到“大戟-甘草”药对缓解肝癌腹水相关的关键网络靶标。3.实验验证:利用前期实验获得的肾组织,通过Western blot和RT-PCR实验,验证“大戟-甘草”药对对前期筛选出的关键网络靶标的蛋白质及基因表达量的影响。再利用体外实验——小鼠肾集合管细胞(M-1)实验进行进一步的验证。成果:1.“大戟-甘草”药对对肝癌腹水小鼠药效的影响实验研究表明,大戟单煎组(0.386 g/Kg/d)小鼠的体重、腹围及腹水量等药效学指标显著低于模型组,表明大戟具有一定的缓解肝癌腹水作用;当大戟-甘草为1:2配伍时(1.158 g/Kg/d),上述药效学指标都显著低于大戟单煎组,表明大戟与甘草1:2配伍时,甘草能协同大戟发挥缓解肝癌腹水作用;当大戟-甘草为1:4配伍时(1.931 g/Kg/d),上述药效学指标都显著高于大戟单煎组,并与模型组小鼠无显著性差异,表明大戟与甘草1:4配伍时,甘草会拮抗大戟发挥缓解肝癌腹水作用。第二批动物实验结果与第一批结果一致。2.“大戟-甘草”药对对肝癌腹水小鼠肝肾功能的影响实验研究表明,模型组与空白组相比,小鼠的肝肾指数(肝指数上升、肾指数下降),肝肾组织生化指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿肌酐、尿素氮等指标上升)及肝肾组织病理学结果均显示,肝癌腹水模型会致使小鼠肝肾功能及结构损伤;各给药组与模型组相比,小鼠的肝肾指数、肝肾组织生化指标及肝肾组织病理学检测均没有显著性差异,表明各给药组不会对肝癌腹水模型小鼠的肝肾功能及结构产生显著性改变,但有改善的趋势。3.“大戟-甘草”药对缓解肝癌腹水的机制研究基于各组小鼠腹膜组织的全基因组表达谱检测结果,分别筛选得到:(1)与肝癌腹水疾病发生相关的靶标基因:2252个;(2)“大戟-甘草”药对缓解肝癌腹水药效的相关基因:86个;(3)通过调研己知治疗腹水药物及其作用靶标:Avpr2。整合(1)(2)(3)部分,通过网络药理学建模,根据网络节点的拓扑特征值(节点连接度、节点介度、节点紧密度和k-core值),推测“大戟-甘草”药对缓解肝癌腹水的作用机制可能与其对Frk-Arhgdib-Inpp5d-Avpr2-Aqp4信号轴的调节相关。4.“大戟-甘草”药对缓解肝癌腹水作用机制的实验验证基于肝癌腹水小鼠肾脏组织,采用Western blot和RT-PCR检测,结果显示,与空白组相比,模型组肾组织中的Frk、Arhgdib、Inpp5d、Avpr2和Aqp4蛋白质和基因表达量均显著上升;与模型组相比,大戟单煎组与大戟-甘草1:2药效协同组小鼠肾组织中上述分子的蛋白质和基因表达量均显著降低,而大戟-甘草1:4药效拮抗组中表达量均显著升高;上述结果在基于体外培养小鼠肾集合管细胞(M-1)的实验中得以验证。结论:大戟具有一定的缓解肝癌腹水的作用,且甘草以不同比例配伍大戟时,对肝癌腹水有不同影响作用:当大戟-甘草以1:2配伍时,甘草能协同大戟缓解肝癌腹水作用,当大戟-甘草以1:4配伍时,甘草会拮抗大戟的缓解肝癌腹水作用;其缓解肝癌腹水作用可能是通过调节Frk-Arhgdib-Inpp5d-Avpr2-Aqp4信号轴来实现的。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

流程图,大戟,转录调控,药对

验流程图逡逑第二节实验材料逡逑一、数据库及软件逡逑数据库逡逑（１）邋Ｓｔｒｉｎｇ数据库：生物分子相互作用信息数据库，收集基因的相互作用信逡逑息，邋（ｖｅｒｓｉｏｎ邋１０，邋ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ／）邋0逡逑（２邋）邋ＤｒｕｇＢａｎｋ邋：查询药物对应的耙标信息，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．邋ｄｒｕｇｂａｎｋ．邋ｃａ／，逡逑９逡逑

情况,大戟,小鼠,甘草

并且存在细胞扩散和放大空置空间的情况；模型组小鼠的肾组织的异常变化存在于逡逑肾小球和肾小管。与模型组相比，大戟组和大戟－甘草协Ｍ组小鼠的病理切片结果显逡逑示，能改善恶性肝癌腹水对肝肾组织的损害。结果见图５。逡逑儒W画逡逑图５各组小鼠肝、肾组织病理切片情况逡逑第二节“大戟－甘草”药对缓解小鼠肝癌腹水的机制研究结果逡逑一、与肝癌腹水生成相关基因的筛选逡逑根据全基因组表达谱数据分析显示：与正常对照组相比，肝癌腹水模型组小鼠逡逑的腹膜组织中共有２２５２个差异表达基因（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ，邋ＤＥＧｓ）逡逑（筛选条件：ｆｏｌｄ邋ｃｈａｎｇｅ邋＞２；尸〈０．０５邋），其中１４１８个上调基因和８３４个下调逡逑２５逡逑

特异性表达基因,分层聚类,趋化因子,小鼠

基因（部分见附录２表Ｓ２）。因为模型组是对空白组小鼠进行腹腔注射腹水造模成逡逑功的肝癌腹水模型小鼠，所以这二者间的２２５２个差异基因我们认为很可能是与肝癌逡逑腹水生成密切相关的关键差异基因。同时，分层聚类分析（图６Ａ）和火山图（图６Ｂ）逡逑的特异表达基因显示，模型组与空白组组间有很好的差异性。逡逑Ａ逦Ｍｏｄ逦Ｃｏｎ逦Ｂ逡逑：（逡逑－Ｔ邋Ｏ邋－？邋０邋－６邋０邋－４邋０逦＞０邋？邋？邋＊？邋■？邋Ｔ？逡逑Ｌｏｇ２ｔＦｏＭ邋Ｃｈａｎｇｅ邋（Ｃｏｎ邋ｙ？．邋？？ｏｄ）逦｜逡逑ｌＪ＾Ｉｂ逡逑图６肝癌腹水模型组与正常组间所有特异性表达基因的分层聚类图（６Ａ）和火逡逑山图（６Ｂ）逡逑同时，通路富集分析结果表明，肝癌腹水小鼠组的上调基因与趋化因子信号通逡逑路（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝８．３４Ｅ＂＇１邋）、Ｆｃ伽马Ｒ－介导的吞嗤作用（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ逡逑校正邋Ｐ值＝６．４８Ｅ＿ｌ）ｆｉ）、ＤＮＡ邋复制（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ邋校正邋Ｐ邋值＝３．邋５３ＥＨＢ邋）、Ｔｏｌｌ邋样受体逡逑信号通路（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝９．邋７０邋Ｅ—＂ａ邋）、细胞周期（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝逡逑５．０２Ｅ＿ＩＭ邋）、自然杀伤细胞介导细胞毒性（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝０．０１邋）、细胞因子逡逑和细胞因子受体相互作用（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝０．邋０２邋）和Ｂ细胞受体信号通路逡逑（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝０．０３）等显著相关

【参考文献】