益气活血通络法对局灶性脑缺血再灌注大鼠血管再生及STAT3、Raf-1、MMP-9蛋白表达的影响

发布时间：2020-07-30 00:25

【摘要】：目的基于中医“气血-脑髓”相关理论,以SCF/c-kit信号调节通路为研究切入点,建立MCAO/R大鼠模型,采用新安王氏内科特色治法益气活血通络法及其代表方(脑络欣通)对其进行干预,动态观察模型大鼠缺血侧额顶叶皮质区血管再生情况及STAT3、Raf-1、MMP-9、CD105等蛋白变化,探讨益气活血通络法对脑缺血后血管再生及其SCF/c-kit信号调节通路的影响和作用机制,为益气活血通络法及其代表方脑络欣通的临床合理应用和开发提供实验依据。方法健康雄性SD大鼠84只,体重300±20g,随机分为假手术组、模型组、脑络欣通组和通心络组,每组各21只,各组下再设亚组,分别为再灌注3天、7天、14天,每亚组各7只。采用改良线栓法建立MCAO/R大鼠模型,闭塞2小时,再灌注,按照Zea Longa评分标准,神经缺损体征评分2~3分入选。按照人和大鼠体表面积折算系数进行等效计量,脑络欣通和通心络分别按1.143g/kg、0.033g/kg的剂量,每天灌胃2次,分别于3天、7天、14天后心脏内灌注,开颅取脑。HE染色法观察各时间点不同组大鼠缺血侧皮质区病理组织变化情况。免疫组化Envision二步法分别检测各时间点不同组大鼠缺血侧皮质区MMP-9、CD105蛋白表达的阳性面积数值。Western-Blot法检测各时间点不同组大鼠缺血侧皮质区STAT3、Raf-1蛋白相对灰度表达量。所得计量资料用均数±标准差(x±s)表示,使用IBM SPSS Statistics 23.0进行统计处理,同一时间点不同组间采用单因素方差分析,LSD进行两两比较,以P0.01或P0.05为有统计学意义。统计图采用GraphPad Prism 5软件制作,统计表使用word 2010软件制作。结果HE染色法结果显示:假手术组神经元细胞排列整齐,组织细胞形态正常。与假手术组相比,模型组各时间点组织水肿、神经元变性坏死表现明显,并伴有炎性细胞浸润,以3天反应最为明显。采用脑络欣通和通心络干预后,各组各时间点的损伤较之模型组有不同程度减轻,神经元变性、坏死减少,核固缩减轻,炎症细胞浸润有所改善。脑络欣通组和通心络组对比,无明显差异。免疫组化结果显示:MMP-9主要表达在缺血侧额顶叶皮质区的神经元细胞、内皮细胞、胶质细胞的胞浆中。CD105的黄褐色沉淀主要在缺血侧额顶叶皮质区的血管内皮细胞胞浆中。不同组别再灌注3天、7天、14天时MMP-9、CD105表达差别总体均有统计学意义(P0.01)。假手术组大鼠大脑额顶叶皮质区MMP-9、CD105蛋白在不同时间点均有少量表达。模型组MMP-9、CD105蛋白表达的阳性面积以3天组为峰值,7天、14天有所下降。与假手术组相比,各同时间点模型组MMP-9、CD105蛋白表达的阳性面积均有明显增高,差异有统计学意义(P0.01)。脑络欣通组和通心络组MMP-9、CD105蛋白表达的阳性面积在各时间点明显上升,以3天最高,7天、14天逐渐降低,且均显著高于模型组,差异有统计学意义(P0.01)。与通心络组比较,脑络欣通组各时间点MMP-9蛋白表达的阳性面积差异均无统计学意义(P0.05)。Western-Blot结果显示:不同组别再灌注3天、7天、14天时STAT3、Raf-1表达差别总体均有统计学意义(P0.01)。假手术组脑组织中有少量STAT3、Raf-1表达,与假手术组相比,模型组各时间点STAT3、Raf-1蛋白表达量均有明显上升(P0.01)。脑络欣通组和通心络组各时间点的STAT3、Raf-1蛋白表达量明显高于模型组,差异有统计学意义(P0.01)。脑络欣通组与通心络组相比,各时间点STAT3、Raf-1蛋白表达量的差异无统计学意义(P0.05)。结论在课题组前期对SCF、c-kit蛋白及局部脑血流量研究的基础上,本实验发现益气活血通络法及其代表方脑络欣通上调CD105蛋白的表达,脑缺血后血管再生数量增加;上调STAT3、Raf-1、MMP-9蛋白的表达,调节SCF/c-kit信号通路,促进脑缺血再灌注后的血管再生,对抗局灶性脑缺血再灌注损伤,发挥治疗作用。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

图 1. 模型制作示意简化图、神经功能缺损体征示意图Fig1. Model production and neurological deficit sign schematic drawing of the mod2.3 取材和保存大鼠造模给药 3 天、7 天、14 天后，分别于第 4 天、第 8 天、第 15 天上00 时，以 3.5%水合氯醛腹腔注射，麻醉后进行心脏内灌流固定，迅速冰面取脑，去除脑干、小脑，保留端脑部分，静置于配好的 10%福尔马林固定意固定液体积应是组织体积 10 倍以上以确保固定液完全覆盖脑组织，4℃藏，固定一周后备用。2.4 组织处理（1）修块：取出标本，流水冲洗固定液，组织修块（前至视交叉，后修三分之放入包埋盒。

17A:假手术组 B：模型组 C：通心络组 D：脑络欣通组图 2. 各组大鼠缺血侧额顶叶皮质区再灌注 3 天组织病理学形态 ( HE，×200)Fig2. Histopathological morphology of the ischemic lateral frontoparietal cortex of each groupreperfused for 3 days(HE, ×200)

A:假手术组 B：模型组 C：通心络组 D：脑络欣通组图 4. 各组大鼠缺血侧额顶叶皮质区再灌注 14 天组织病理学形态( HE，×200)Fig4. Histopathological morphology of the ischemic lateral frontoparietal cortex of each groupreperfused for 14 days(HE, ×200).2 益气活血通络法对大鼠脑缺血再灌注损伤后 MMP-9 蛋白表达的免疫组化结果显示：400 倍视野下，MMP-9 主要表达在缺血侧额顶叶皮质神经元细胞、血管内皮细胞、神经胶质细胞的胞浆中。不同组别再灌注 3 天、、14 天时 MMP-9 表达差别总体均有统计学意义（P<0.01）。假手术组大鼠大顶叶皮质区 MMP-9 蛋白在不同时间点均有少量表达。模型组 MMP-9 蛋白的阳性面积以 3 天组为峰值，7 天、14 天有所下降。与假手术组相比，各同点模型组 MMP-9 蛋白表达的阳性面积均有明显增高，差异有统计学意

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本文编号：2774719