复方肝豆汤成分分析及其在大鼠体内代谢研究

发布时间：2020-07-30 07:49

【摘要】：目的:肝豆汤为中医治疗肝豆状核变性(Hepatolenticular Degeneration,HLD)的经典方,由于临床疗效确切,该方被《肝豆状核变性诊断与治疗指南》推荐为治疗HLD基本方剂,临床上一直沿用至今。目前由于缺乏对肝豆汤的化学成分和体内过程研究,该方物质基础尚不明确,限制了该方的应用和发展。本论文利用超高效液相色谱(UPLC)及超高效液相色谱时间飞行质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术对肝豆汤中化学成分及大鼠体内代谢物进行系统分析研究,为揭示肝豆汤的物质基础研究提供坚实的实验基础。方法:通过色谱条件摸索,建立了肝豆汤UPLC指纹图谱质量控制方法;采用UPLC-Q-TOF-MS~E技术结合UNIFI分析平台建立肝豆汤化学成分的快速分析方法,构建肝豆汤质谱数据库,对该方整体化学成分进行了分类和归属;通过构建铜负荷大鼠模型,灌胃给药肝豆汤,采用UPLC-Q-TOF-MS~E技术,结合体外化学成分信息,鉴定大鼠口服肝豆汤后入血、入肝成分,探讨肝豆汤在铜负荷模型大鼠和正常大鼠体内吸收代谢差异;在此基础上采用UPLC-Q-TOF-MS技术结合非靶标代谢组学的方法,进一步对肝豆汤在大鼠尿液中的原型成分和代谢物进行分析,对肝豆汤在大鼠体内代谢产物及代谢途径进行了系统研究。结果:1.建立了不同批次肝豆汤的UPLC指纹图谱方法,确定了17个共有峰,通过精密度、稳定性、重复性对该方法进行验证;采用UPLC-Q-TOF-MS~E技术结合UNIFI天然产物分析策略,建立了复方肝豆汤数据库,对肝豆汤中的化学成分进行了分析鉴定,共计鉴别出96个化合物,对每个化合物的结构进行总结归类并对其单味药来源进行归属,包括21个蒽醌类化合物,14个生物碱类化合物,17个原萜烷型三萜类化合物,10个黄酮化合物,8个皂苷类化合物,10个鞣质类成分,4个姜黄素类化合物,2个苯丁酮苷,4个倍半萜类和6个其他类成分,全面系统地分析了肝豆汤中的化学成分。结果表明,本方法能够快速全面地对肝豆汤化学成分进行鉴别。2.构建铜负荷大鼠模型,采用UPLC-Q-TOF-MS~E技术结合UNIFI分析平台鉴定了大鼠口服肝豆汤入血入肝原型成分及代谢物。正常给药大鼠血浆中共检测到54个成分入血,包含36个原型入血成分,18个代谢产物,其中有21种原型成分及8个代谢产物在正常大鼠肝组织中被检测到。在铜负荷模型大鼠血浆中共检测到46个成分入血,包含30个原型入血成分和16个代谢产物,其中有18种原型成分及5个代谢产物在正常大鼠肝组织中被检测到。入血的主要成分为蒽醌,生物碱和原萜烷型四环三萜类成分,还有少量皂苷、黄酮和鞣质类成分;大黄中的蒽醌及泽泻的原萜烷型四环三萜类成分是主要的入肝成分。3.采用UPLC-Q-TOF-MS结合非靶标代谢组学方法分析大鼠口服肝豆汤后尿液中的成分,在大鼠体内共检测到77种化学成分,包括45种原型成分和32种代谢产物,主要为蒽醌类、原萜烷型萜类化合物及少量皂苷黄酮鞣质类化合物,对肝豆汤体内成分进行了系统阐明,并推断肝豆汤中蒽醌类成分在大鼠体内的主要代谢途经为葡萄糖醛酸化和硫酸化;生物碱类成分的主要代谢途经为羟基化、去甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等,为肝豆汤的药效物质基础研究提供了实验依据。该方法可作为中药复方代谢物组快速鉴定的重要工具。结论:本研究建立了肝豆汤中化学成分和体内代谢物的快速筛选和鉴定方法,初步阐明了该方化学成分和体内代谢情况,为该方质量控制及物质基础研究提供依据。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

色谱图,色谱图,乙腈,色谱条

图 1 不同波长下肝豆汤色谱图Fig 1 The chromatograms of GDD in different wavelengths:203nm; B:210nm; C:230nm; D:260nm; E:280nm; F:320nm的选择同组成的流动相（甲醇-水，乙腈-水）对肝豆汤各成流动相，经过多次预实验摸索，确定实验的色谱条ilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；-乙腈 B；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30℃；进样量：

谱图,指纹图谱,谱图,相似度

3.1.3 重复性取同一批次肝豆汤按照“2.1”项下方法平行制备肝豆汤供试液 6 份，并按“2.3.2”项下色谱条件，记录 UPLC 图谱，得到峰面积，结果各峰的相对保留时间和峰面积的 RSD 值均小于 3.0%，表明该方法的重复性良好。3.2 肝豆汤的 UPLC 指纹图谱相似度分析10 批复方肝豆汤 UPLC 指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱特征图谱相似度评价系统”（2004 A 版），利用中位数法，时间窗为 0.1 min，生成十个批次复方肝豆汤共有模式下的指纹图谱及对照谱图，见图 2，找出 17 个共有色谱峰，其中峰 5、7、8、9、16 的峰面积相对较大。相似度评价结果表明，不同批次的指纹图谱与对照谱之间的相似度详见表 2，相似度均在 0.980 以上，符合指纹图谱的要求[52]。

色谱图,提取物,对照品,色谱图

8 0.997 0.998 0.989 0.990 0.999 0.999 0.989 1.000 0.999 0.989 09 0.997 0.998 0.993 0.993 0.999 0.999 0.992 0.999 1.000 0.993 00 0.991 0.995 0.985 0.988 0.990 0.993 0.998 0.989 0.993 1.000 0 0.996 0.995 0.998 0.998 0.997 0.998 0.998 0.995 0.998 0.998 13 肝豆汤的 UPLC 指纹图谱建立和指认S1～S10 共十个批次肝豆汤样品供试液按照“2.1”项下方法进行配制，“2.3.2”项下的 UPLC 色谱条件进行检测，得到各样品的 UPLC 色图谱，对照品确认出 9 个化合物，分别为盐酸小檗碱，槲皮素，芦荟大黄素，大黄奈素，姜黄素，大黄素，大黄酚和大黄素甲醚，详见图 3。选取保留时间和积稳定且适中的共有峰（盐酸小檗碱）作为参照峰（S 峰），将盐酸小檗碱时间、峰面积设为 1，分别计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积见表 3、4。

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