基于“肾主骨”理论的骨质增生止痛丸生物学机制研究

发布时间：2020-07-31 22:26

【摘要】：目的:基于“肾主骨”理论对骨质增生止痛丸的生物学机制进行分析。方法:从细胞水平和动物水平对骨质增生止痛丸的生物学机制进行深入研究。通过RNA-seq高通量测序技术建立骨质增生止痛丸作用后的原代软骨细胞及肾脏组织的转录组数据库,结合生物信息学分析方法,对转录组数据库进行差异基因表达分析,功能注释及代谢通路分析,挖掘基于“肾主骨”理论的骨质增生止痛丸的生物学机制。结果:1.CCK-8实验结果表明骨质增生止痛丸能够显著促进原代软骨细胞增殖,且呈现一定的量效关系。骨质增生止痛丸在0.8 mg/ml和1.0 mg/ml浓度时对软骨细胞的促增殖活性最佳,效果基本相同。2.构建了骨质增生止痛丸作用后的小鼠原代软骨细胞转录组数据库,通过生物信息学分析共鉴定出229个差异表达基因,其中骨质增生止痛丸处理组显著上调的基因139个,显著下调的基因90个。GO功能富集分析结果表明骨质增生止痛丸主要通过应激反应的调节、免疫应答调节、多细胞组织过程的调节以及细胞内信号转导的调节实现对原代软骨细胞的调控作用。KEGG代谢通路富集分析结果表明骨质增生止痛丸通过参与TNF信号通路、NF-κB信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路的调节对原代软骨细胞进行调控。在骨质增生止痛丸的作用下,小鼠软骨细胞中10种具有正向调节细胞增殖作用的基因表达水平呈上调趋势,包括Tnfaip2、Chi311、Tnf、Pfkfb3、Sox8、Jag1、Mafb、Pla2g7、Hnrnpa1和E2f3,7种具有负向调节细胞增殖作用基因的表达水呈下调趋势,包括Rhob、Dusp6、Plk3、Fgf21、Rad9a、Filip1l和Rasl11b。此外,骨质增生止痛丸可以提高Sox9、Sox5、Sox6、Acan、Col2a1、Col9a1、Col11a1、Hapln1和Wwp2在内的9种软骨发育早期成软骨标志物的基因表达水平。3.构建了骨质增生止痛丸作用后的大鼠肾脏组织转录组数据库,通过生物信息学分析共鉴定出709个差异表达基因,其中骨质增生止痛丸处理组显著上调的基因255个,显著下调的基因454个。GO功能富集分析结果表明骨质增生止痛丸主要通过离子转运(尤其是阴离子的转运)、有机酸的转运、细胞外基质和结构组织的调控进而实现对大鼠肾脏功能的调控。KEGG代谢通路富集分析结果表明骨质增生止痛丸通过参与细胞外基质受体间相互作用、甲状腺激素信号通路的调节以及PI3K-Akt信号通路的调节进一步对大鼠肾脏相关功能进行调控。在骨质增生止痛丸的作用下,大鼠肾脏中3种具有正向调节软骨细胞或细胞外结构的基因表达水平呈上调趋势,包括Ucma、Scin和Cited1,13种具有负向调节软骨细胞或细胞外结构的基因表达水呈下调趋势,包括Cyp27b1、Igsf10、Adamts4、Nfil3、Maf、Fbn1、Amer1、Gas2、Omd、Bnc2、Fn1、Cilp和Col27a1。结论:骨质增生止痛丸能够以剂量依赖的方式促进原代软骨细胞增殖,显著提高软骨细胞的促增殖活性,同时对软骨细胞的分化、细胞外基质的破坏具有一定的抑制作用。骨质增生止痛丸可以通过对肾脏基因的调控,促进软骨细胞的增殖与软骨祖细胞的分化,抑制软骨细胞的分化,维持软骨支架的稳定,进而参与软骨形成,保护软骨结构,实现补肾健骨的功效。
【学位授予单位】：长春中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

（3）按照 100 μl/孔将两组药物按不同浓度分别加至相应的 96 孔板中对原代软骨细胞进行干预，轻轻摇匀后转至 5%CO2培养箱（37℃）中继续培养 24 h；（4）取出 96 孔板，在避光条件下向每孔中加入 10 μl Cell Counting Kit-8 试剂，放回至培养箱再次孵育 1 h；（5）再次取出 96 孔板，利用酶标仪震荡后在 450 nm 处检测吸光度，按不同浓度 GZZSZTW 和 DAE 给药后软骨细胞的存活率计算软骨细胞增殖率。3 实验结果3.1 原代软骨细胞的提取分离在倒置显微镜的观察下可见，从 C57BL/6J 乳鼠肋软骨中分离出的原代软骨细胞在溶液中呈晶莹的颗粒状悬浮于培养基中，培养 5 h 后，软骨细胞大部分完成贴壁，贴壁后的软骨细胞呈多角形，培养 24 h 时后，软骨细胞依然保持良好的生物活性。

长春中医药大学 2019 届博士学位论文之增加，最高增殖活性均保持在 110%以上。其中，在骨质增生止痛丸提取物的作用下，软骨细胞的增殖活性从 0.8 mg/ml 的药物浓度时开始趋于平缓，与 1mg/ml 浓度的作用近乎平行；而在鹿茸提取物的作用下，软骨细胞的增殖活性从0.6 mg/ml 浓度时开始趋于平缓，同 0.8 mg/ml 的浓度以及 1 mg/ml 浓度的增殖作用几近相同。骨质增生止痛丸提取物在 0.8 mg/ml 的药物浓度表现出的增殖作用与鹿茸提取物在 1 mg/ml 浓度下的作用几近相同。

TW 组和 BLANK 组原代软骨细胞总 RN止痛丸处理组，B 代表空白组，Marker g Buffer，电泳时间 10 min。和 BLANK 组原代软骨细胞总 RNA 紫外BLANK 88.25 1.89 50 平台测序和数据过滤处理后，对过

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 郝松;孟越;李威;胡少宇;杨德鸿;;甲状旁腺素非PLC依赖PKC通路激活增强成骨细胞CITED1表达[J];南方医科大学学报;2015年04期

2 王智民;郑洪新;;中医“肾主骨”之理论内涵及临床意义[J];中华中医药学刊;2013年07期

3 戴中;刘强;白文;柳洪胜;杨嘉颐;王少杰;;针刺治疗膝关节骨性关节炎疗效观察[J];中国针灸;2012年09期

4 王曦;汪小我;王立坤;冯智星;张学工;;新一代高通量RNA测序数据的处理与分析[J];生物化学与生物物理进展;2010年08期

中国博士学位论文全文数据库 前6条

1 莫永豪;温针灸治疗膝骨性关节炎的临床疗效观察[D];广州中医药大学;2015年

2 吴广文;独活寄生汤对骨性关节炎软骨细胞增殖与凋亡影响的实验研究[D];福建中医药大学;2014年

3 洪昆达;川芎嗪治疗膝骨性关节炎的临床观察及对兔关节软骨细胞增殖与凋亡的影响[D];福建中医药大学;2013年

4 吴宛容;不同时间间隔对膝骨性关节炎针刺效应研究[D];广州中医药大学;2013年

5 徐逸生;补肾活血复方对骨关节炎疗效观察和滑液MSCs的影响[D];广州中医药大学;2013年

6 伍捷进;健骨颗粒冲剂治疗膝骨关节炎的实验研究与临床观察[D];南方医科大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 杨晓建;整脊疗法为主治疗脊源性膝关节骨性关节炎临床研究[D];广州中医药大学;2011年

本文编号：2777089