时间分辨及化学计量学辅助荧光法对中药活性成分的定性鉴定与定量分析

发布时间：2020-08-03 10:10

【摘要】：中医药不仅在亚洲几个国家中的防病和治病方面起着重要作用,而且由于其在治疗慢性疾病方面的良好疗效和低毒性,在世界范围内赢得了越来越多的声誉。通常,大多数中药是含有不同植物化学成分的复杂混合物,其中只有少数成分具有生物活性。而生物活性成分的含量因地理来源、气候、栽培和收获时的生长阶段而异,从而改变其治疗效果。因此,为了保证临床应用的可靠性和重复性,对药用植物的生物活性成分进行鉴定和测定是十分必要的。目前,中药成分的定性和定量分析的主要方法是LC-MS。虽然其分析性能优异,但对目标物的分析往往是费力、相对昂贵和费时的。因此,发展更简单和更环保的方法,即不经分离和尽量减少使用有机溶剂,具有重要意义。荧光光谱已经被认为是非常有用的绿色方法,由于其灵敏度高、选择性好、使用方便、仪器通用性强、分析速度快和对样本的无损性。然而,由于天然药物组分众多,且大多为未知成分,分析物与潜在干扰物之间通常会发生严重的光谱重叠,而导致测量数据的严重共线性。因此我们探索应用具有二阶优势的化学计量学算法来提高复杂样品分析方法的选择性。时间分辨荧光是分离荧光团的另一种有效手段,因为光谱重叠信号常常可以通过不同的荧光寿命进行分离。利用时间分辨荧光技术可以帮助开发非破坏性的方法来确定化学成分。目前,尚未见利用荧光寿命分离方法对中药活性成分的定性鉴定的研究报道。本工作的目的是开发一种基于时间分辨荧光的中药活性成分定性鉴定方法,以及基于激发-发射荧光(EEM)结合二阶校正的快速、可靠的定量分析方法。第一章概述本章介绍了解析复杂体系分析问题的最常用的化学计量学二阶校正方法,比如,二阶数据分析的标准方法,即平行因子分析(PARAFAC),MCR-ALS(多元曲线分辨-交替最小二乘法),ATLD(交替三线性分解)及其变体,以及U-PLS/RBL和N-PLS/RBL(结合残差双线性化的展开和多维偏最小二乘法)。详细讨论了一系列应用示例,主要是针对激发-发射荧光和时间分辨发射光谱(TRES)的数据。第二章同时测定知母中光谱重叠严重的新芒果苷和芒果苷的几种二阶算法的比较研究本工作主要基于荧光的高灵敏度和化学计量学校正算法的高选择性,提出了一种同时测定新芒果苷和芒果苷的更绿色环保的方法。我们首先比较了两组化学计量学算法的分析性能,包括三线性算法PARAFAC、ATLD、SWATLD(自加权交替三线性分解)和APTLD(交替惩罚三线性分解),以及基于PLS的U-PLS/RBL和N-PLS/RBL。通过预测相对误差(REP%)、平均回收率(Rec%)和预测均方根误差(RMSEP)等统计学参数进行评价。对验证集的预测结果表明,三线性算法对新芒果苷的预测值令人满意,而芒果苷的预测值不能接受;而U-PLS和N-PLS对两种分析物的预测都非常成功。因此,选择U-和N-PLS/RBL同时测定复杂实际样本中的新芒果苷和芒果苷,其中U-PLS/RBL算法的结果最佳。最后,本法的结果与高效液相色谱法测定的浓度进行了比较,结果令人满意。第三章化学计量学辅助激发-发射荧光同时测定秦皮中秦皮甲素、秦皮乙素和秦皮苷基于测定EEM和二阶校正数据处理,开发了一种不经色谱分离,而直接测定秦皮样本中光谱高度重叠的秦皮甲素、秦皮乙素和秦皮苷的新方法。测定校正样、验证样和10个不同产地的秦皮样的激发-发射矩阵,其发射波长在420和550nm范围内,激发波长在300和410nm范围内。我们比较了二组化学计量学算法的分析性能,包括三线性算法和基于PLS的方法。评估的统计学参数包括解析光谱的质量(发射和激发光谱的相关系数,R_(em)和R_(ex))、预测浓度和标称值之间的相关系数、预测相对误差(REP%)、平均回收率(Rec%)和预测均方根误差(RMSEP)。值得注意,作为解析算法,两种三线性算法可以对验证样中的三种化合物的光谱进行正确分辨,而无需提供任何先验信息。定量结果表明,U-PLS/RBL和N-PLS/RBL性能最优,秦皮甲素和秦皮乙素的相对预测误差小于3.2%,秦皮苷的相对预测误差小于5.5%。这说明使用潜在变量的算法,算法结构足够灵活,可以克服分析物之间高度光谱相似的问题。因此,我们选择了U-PLS/RBL法来测定更复杂的实际样本,并通过用紫外检测器的液相色谱法对该方法的结果进行了验证。本实验过程简单,绿色环保,以及准确可靠,为中草药活性成分的定量提供了一个有价值的方法。第四章时间分辨荧光和化学计量学辅助时间分辨发射光谱用于中药活性成分的定性鉴别和定量分析本文提出了一种利用时间分辨(寿命)荧光定性鉴定中药丁公藤中东莨菪内酯和东莨菪甙的新方法。由于分析物和干扰物之间存在显著的光谱重叠,首次提出在中药质量控制中使用更具选择性的时间分辨荧光进行定性鉴定。用FLS-980荧光光谱仪(爱丁堡)记录时间分辨荧光。荧光寿命和时间分辨发射光谱的测量采用标准的时间相关单光子计数法。通过爱丁堡提供的FLS-980解卷积软件,将荧光强度衰减曲线拟合为一到四个指数衰减。拟合的可靠性通过卡方值(χ~2)和残差分布进行检验。实验结果表明,两种纯分析物的所有荧光衰减曲线数据均符合单指数衰减,东莨菪内酯的荧光寿命为4.91±0.03 ns,而东莨菪甙的荧光寿命为2.14±0.03 ns。分析物的荧光寿命不依赖于发射波长和样品浓度。对测定的丁公藤提取液的时间分辨荧光衰减曲线(358.2 nm脉冲光激发,在430 nm记录荧光强度衰减曲线,因为430 nm处两者都能发光)进行指数拟合处理。用单指数拟合荧光衰减曲线的χ~2值为9.55,用双指数拟合的χ~2值为1.22,而三指数拟合的χ~2值为1.19。我们确定采用两个寿命的指数衰减的拟合结果,因为此时的残差已经呈现出了均匀的分布。用两个指数衰减拟合函数求解的两个寿命值分别为4.88±0.04 ns和2.17±0.04 ns,这些数值与丁公藤中的活性成分东莨菪内酯和东莨菪甙的实际寿命值吻合较好,表明成功实现了中药化学成分的定性鉴别。当使用三组分拟合时,除了两种分析物之外,中药基体中还存在另一种寿命较长的组分,约为9.1±2.6 ns(但信号较低,强度占总强度约为2%),这导致χ~2值略有下降。还采用时间分辨发射光谱TRES并结合二阶校正方法解析,成功实现了含有丁公藤等中草药的冯了性药酒和风痛药酒中东莨菪内酯的定量分析。本法的浓度预测结果与高效液相色谱的结果没有显著差异。因此,本文提出的利用时间分辨荧光进行中药活性成分的定性分析,及TRES结合二阶校正进行中药复杂体系的定量分析的方法,为中药色谱法提供了合适的替代方法。
【学位授予单位】：河北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;R284.1
【图文】：

数据,分析数据,样本

嗉崩幢泶铩２煌?“阶”和“维”的分析化学数据类型如图1.1 所示[10-12]。具体地，对于单个样本的测量数据，标量是零阶数据，向量是一阶数据，矩阵是二阶数据，而立方阵是三阶数据。例如测定单个波长的吸光度或离子选择性电极的响应值就是零阶数据。若测定一个样本的矢量型数据，例如紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、傅里叶变换红外光谱则属于一阶数据。而测定的单个样品的响应矩阵则是二阶数据，比如用带有二极管阵列检测的高效液相色谱(HPLC-DAD)、带质谱检测的气相色谱(GC-MS)和激发发射荧光光谱仪就产生典型的二阶分析数据。另一方面，对于一组样本的测定数据，在样本方向上可以构造具有附加维度的阵列，称之为不同维的数据。例如，可以将多个样本的单个测量值组合形成一个矢量，也可以将一阶数据彼此相邻放置而形成矩阵等等，则它们分别被称为一维、二维和三维数据等。图 1.1 分析数据结构的“阶

三维数组,样本,方向,数据

EEMaEmExET 为组分的浓度，Em 为发射光谱列向量，ExT为激发光谱行向量，个含有 N 个组分的样本，如果每个成分的响应都可以用等式(1.1没有相互作用（即一个成分的存在不会改变其它成分的响应），M 可以写成下式： 1 NTn n nnEEM a Em Ex E n、Emn、TnEx 分别为第 n 个组分的浓度、发射光谱列向量和激发声。定一系列不同含量的同类样本，并将所有的测量矩阵堆叠为三维 1.2 所示：

数据结构图,实验体系,数据结构,立方阵

双线性的概念就扩展成为三线性，即三维立方阵可以分解为三线 1 Nn n nnX a Em Ex E 表示 Kronecker 积，立方阵 X 中的第 i 个水平切片是第 i 个样K)。在文献中，(1.3)式一般表达为如下：XENnnnn 1a bc 表示一个包含两个组分体系的三线性数据结构。

【相似文献】