瑶山南星抗结核杆菌活性成分的分离、鉴定及作用机制研究

发布时间：2020-08-03 11:43

【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的高感染和高致死性的慢性传染病。近年来,由于耐多药结核病(MDR-TB)和广泛耐药结核病(XDR-TB)的出现,以及结核病与艾滋病的交叉感染,使结核病的致死率已超过艾滋病位居第九,无疑给人类健康带来严重的威胁。尽管已有治疗结核的药物,但是治疗时间过长(6-9月),导致部分病人不能坚持服药,引起耐药菌出现;另外,由于部分抗结核药物肝毒性明显,长期服药可导致病人肝损伤。因此,发现新型药物,缩短结核治疗时间是近年来研究热点。大量研究证明,结核分枝杆菌形成生物膜(Biofilm,BF),能使结核分枝杆菌产生表型耐药,是结核分枝杆菌耐药的重要机制之一,如果抑制结核杆菌生物膜的形成或破坏已形成的生物膜,将有利于细菌恢复对抗痨药物的敏感性,从而提高结核病的治疗效果,缩短治疗周期。中草药是新药发现的重要来源之一,我国中草药资源丰富,品种繁多,本项目组前期利用贵州中草药资源的多样性,以及丰富的民族药资源,进行过筛选试验,发现侗族民间治疗结核的单味药瑶山南星(Arisaema sinii Krause)具有抑制结核杆菌生物膜的活性。本实验研究了瑶山南星抑制结核杆菌生物膜的活性成分并进行了初步机制探讨。首先,采用热回流方法,获得瑶山南星乙醇提取物。然后进行萃取分段,分别得到石油醚层萃取部位、乙酸乙酯层萃取部位、剩余层。采用生物膜形成计分法评价抗生物膜活性,实验结果显示,石油醚层萃取部位具有较好的抑制结核杆菌生物膜形成的活性,呈明显的量效关系,药物浓度为1mg/mL时,生物膜计分为2.0,药物浓度为2mg/mL时,生物膜计分为1.3。采用改良罗氏培养基绝对浓度法测定不同部位的体外抗结核杆菌活性,发现石油醚层萃取部位无抑制结核杆菌的活性,而乙酸乙酯部位具有抗菌活性(MIC=1mg/mL)。实验结果提示,瑶山南星乙醇提取物既具有抑制结核杆菌生物膜的化合物,同时还存在抗结核杆菌的化合物。为分离瑶山南星生物膜抑制剂,本实验采用硅胶柱色谱进一步对石油醚层进行分段,并测试不同组分的活性,经过反复过柱纯化,分离得到抑制结核杆菌生物膜的化合物单体YS-01(80 mg)。化合物YS-01为灰白色油状物,ESI-MS m/z:601.2[M+H]~+,~1H NMR(500 MHz,CDCl_3-d6):7.70(s,-NH-,1H),7.53(s,-NH-,1H),6.23-5.49(t,3H),6.03(d,1H),5.50(s,J=8.2 Hz,Dp-CH-,2H),5.45(dt,J=18.1 Hz,3H),5.21-4.67(m,7H),2.48(dt,4H),2.21(dt,4H),1.87(dt,J=14.9 Hz,4H),1.63(t,2H),1.64-0.97(d,15H),1.34-0.86(d,9H),0.95-0.77(t,3H),~(13)C NMR(100 MHz,CDCl_3-d6)δ199.76,171.82,167.77,132.44,130.88,128.80,123.72,68.16,55.99,55.87,53.80,45.81,42.38,39.61,38.72,36.11,35.61,33.97,32.96,32.04,30.35,29.69,28.92,28.19,26.04,24.18,23.74,22.98,21.02,19.81,19.01,18.69,17.38,14.05,11.94,10.95。鉴定为:3,6,8-三甲基癸-1-烯-1-基3,6-二氧代-5-(4,8,10,13-四甲基十四碳-2,6-二烯酰基)-哌嗪-2-羧酸甲酯。采用生物膜计分法,发现YS-01在浓度为4μg/mL时,能抑制结核杆菌生物膜形成,8μg/mL时,生物膜基本不能形成。扫描电子显微镜观察到在活性单体药物浓度为32μg/mL时,可破坏已经形成的结核杆菌生物膜。YS-01与一线抗痨药物联用,体外抗BCG活性实验表明,YS-01与一线抗结核药物异烟肼(1/2MIC)、利福平(1/2 MIC)和吡嗪酰胺(1/2 MIC)联用后,均表现出良好的协同作用。Pks1基因与结核杆菌生物膜形成有关,该基因表达产物为聚酮合成酶,聚酮类脂肪酸是结核杆菌生物膜的主要成分。利用实时荧光定量PCR技术,初步探索活性单体化合物YS-01对结核分枝杆菌H37Rv菌株中Pks1基因的表达调控的影响,采用2~(-??)Ct法进行结果分析,实验结果显示,与空白对照比较,被化合物单体YS-01干预后的结核杆菌,基因Pks1表达量明显上调,其2~(-??)值是空白对照的93倍。为此,我们推测YS-01是结核杆菌聚酮合成酶抑制剂。综上所述,本论文对瑶山南星抗结核杆菌生物膜活性进行了评价,跟踪分离得到有效单体化合物,鉴定了化合物的结构,初步探讨了其抑制结核杆菌生物膜形成的分子机制,为研发抗结核药物提供了新的思路。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284
【图文】：

瑶山,南星

图 2-1 瑶山南星Figure 2-1 Arisaema sinii Krausesaema sinii Krause）：天南星科（Araceae）天中药材市场，为瑶山南星块茎部位，2000核分枝杆菌 H37Rv，贵阳市肺科医院结核（购自 ATCC）。程中严格遵守无菌操作等规程，严格执行。

瑶山,石油醚萃取,南星,抗结核

图 2-4 瑶山南星石油醚萃取部位抗结核分枝杆菌结果Figure 2-4 Results of anti-tuberculous mycobacteria in the extraction site of petroleum ether ofArisaema sinii Krause注：从左到右的药物浓度依次为：2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、空白。Note：From left to right：2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、Blank。

瑶山,南星,抗结核,分支杆菌

【参考文献】