基于气滞血瘀型子宫肌瘤病证结合动物模型研究三棱-莪术的相须配伍规律

发布时间：2020-08-03 13:34

【摘要】：目的:在中医基础理论的指导下,采用雌孕激素负荷法结合多因素刺激法建立气滞血瘀型子宫肌瘤病证结合动物模型。通过观察子宫形态和病理,分析大鼠子宫组织、卵巢组织和血清中的雌激素、孕激素、雌激素受体、孕激素受体、成纤维细胞活化蛋白的表达,基于“方病证、药病证、有效组分与病证、有效成分与病证”创新药物发现模式,从整体、器官、组织、分子多层次探究三棱-莪术组分配伍水煎液、三棱-莪术组分及组分配伍对气滞血瘀型子宫肌瘤的防治作用与作用机制及三棱莪术相须配伍规律,为子宫肌瘤的科学研究、方剂配伍规律研究提供新方法、新思路,为临床应用提供一定科学依据。方法:1、大鼠分组、造模和给药。将大鼠随机分为空白组、模型组、阳药组、三棱-莪术组分配伍(1:1)高剂量组、三棱-莪术组分配伍(1:1)中剂量组、三棱-莪术组分配伍(1:1)低剂量组、三棱-莪术组分配伍(1:2)组、三棱-莪术组分配伍(2:1)组、三棱总黄酮组、莪术挥发油组、三棱-莪术水煎液组。除空白组外,其他各组每日灌胃给予己烯雌酚药液1.35mg/kg,另每周一、三、五下肢外侧肌肉注射黄体酮注射液1.0mg/只,连续5周;从第四周开始皮下注射盐酸肾上腺素注射液0.9mg/kg·d~(-1),四小时后给予慢性不可预见性刺激((1)60db噪音刺激连续3h,(2)昼夜颠倒,(3)5-10℃冰水浴游泳4min,(4)悬尾10min,(5)50℃烘箱烘10min,每日随机给予1种刺激,并保证整个周期中每种刺激不少于2次),连续2周。空白组每日给予生理盐水2ml,另每周一、三、五下肢外侧肌肉注射生理盐水0.05ml/只,连续5周。从造模第一周开始,在造模后2小时即给予药物治疗,各组分别灌胃给予生理盐水、生理盐水、9%的宫瘤消胶囊药液、66.7%、33.3%、16.7%的三棱莪术(1:1)配伍组药液、100%的三棱莪术(1:2)配伍组药液、100%的三棱莪术(2:1)配伍组药液、66.7%的三棱总黄酮药液、66.7%的莪术挥发油药液、三棱-莪术水煎液,连续5周。2、大鼠各指标的观察和检测。(1)大鼠一般行为学观察。试验过程中观察各组大鼠的一般行为学状态。(2)子宫形态和病理组织学。各组大鼠最后一次给药后,禁食12h,称重后,解剖,取出子宫组织,剔除脂肪,清除血迹,拍照记录子宫形态。然后取子宫分角上有较明显病变(水肿、结节、囊肿、空泡变性等)组织,制作病理切片。(3)子宫、卵巢系数和子宫横竖径的检测。大鼠解剖后,取出子宫和卵巢,剔除脂肪,清除血迹,称取各脏器湿重,计算子宫、卵巢脏器系数(脏器系数=脏器湿重/大鼠体重×100)。子宫横径,游标卡尺选取子宫体最宽处进行测量。子宫竖径,游标卡尺选取子宫分角上,较长的一侧子宫的长度。(4)大鼠血清中各指标的检测。大鼠股动脉取血,15ml离心管储存,室温血液自然凝固10-20min,3000r/min,离心20min,仔细收集血清。4℃冰箱保存,尽快用酶联免疫试剂盒测定血清中的E_2、ER、P、PR的含量。(5)卵巢、子宫组织中各指标的检测。剪取适量组织,称重后放入匀浆管中,1:9比例加入PBS,匀浆机2000r/min,1min进行匀浆。然后取出匀浆管离心3000r/min,20min,仔细收集上清,采用酶联免疫试剂盒检测子宫、卵巢中的E_2、ER、P、PR的含量。剪取子宫组织,称重,剪碎后置于匀浆机中,加入RIPA细胞裂解液30min,后12000rpm/min离心10 min,收集上清液,用蛋白质印迹法(Western Blot)测定大鼠子宫组织中成纤维细胞活化蛋白(FAP)的含量。结果:1、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对大鼠外观、子宫形态与病理组织学的影响。与空白组比较,模型组和各用药组大鼠造模后,外观呈现毛色暗淡无光、皮毛凌乱、脱落、毛根不固等改变。与空白组相比,模型组大鼠双侧子宫形态发生改变,宫体出现囊肿、结节、水肿,双侧子宫出现大小不一、形状不对称等病理改变,其他各组大鼠子宫出现不同程度的水肿、结节、囊肿、质地不均等病理改变。与空白组比较,其他各组大鼠病理切片分析结果显示有肌纤维排列紊乱、增厚,肌细胞增生、炎细胞浸润等病理表现。其中三棱莪术水煎液组和S-E(1:1)高剂量组大鼠的外观和子宫病理改变较其他用药组轻。2、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对子宫、卵巢系数和子宫横竖径的影响与空白组比较,模型组大鼠子宫、卵巢系数和子宫横竖径均升高。与模型组比较,各用药组大鼠子宫、卵巢系数和子宫横竖径均有不同程度的降低,其中三棱莪术水煎液和S-E(1:1)高剂量组大鼠子宫、卵巢系数和子宫横竖径降低较明显。3、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对大鼠血清中E_2、ER、P、PR含量的影响与空白组比较,模型组大鼠血清中E_2、ER、P、PR的含量明显升高。与模型组比较,各用药组大鼠血清中的E_2、ER、P、PR含量均有所降低,其中三棱莪术水煎液组大鼠血清中E_2、ER、P、PR的含量降低明显。三棱-莪术组分配伍(1:1)高剂量组大鼠血清中E_2、P、PR含量降低明显,ER含量也有所降低。4、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对大鼠卵巢组织中E_2、ER、P、PR含量的影响与空白组比较,模型组大鼠卵巢组织中E_2、ER、P、PR的含量明显升高。与模型组比较,其他各组阿叔卵巢组织中的E_2、ER、P、PR均有所降低,其中三棱莪术水煎液组能明显抑制卵巢组织ER和P的表达,三棱-莪术组分配伍(1:1)高剂量组大鼠卵巢组织中ER、P、PR含量降低明显,E_2含量也有所降低。较其他用药组效果好。5、基于“方病证”、“有效组分与病证”研究三棱莪术及其组分配伍对大鼠子宫组织中E_2、ER、P、PR、FAP含量的影响与空白组比较,模型组大鼠子宫组织中E_2、ER、P、PR、FAP的表达明显升高。与模型组比较,各用药组子宫组织中E_2、ER、P、PR、FAP的表达均有所降低,其中三棱莪术水煎液组能明显抑制子宫中ER、P、PR、FAP的表达,三棱-莪术组分配伍(1:1)高剂量组子宫组织中E_2、ER、P、PR、FAP含量降低明显,较其他用药组效果好。结论:以上结果表明,三棱莪术水煎液能改善气滞血瘀型子宫肌瘤大鼠外观、子宫形态,减轻子宫病理改变,明显降低大鼠血清、卵巢和子宫组织中E_2、ER、P、PR、FAP的含量。三棱总黄酮、莪术挥发油和三棱莪术组分配伍不同比例对大鼠子宫形态、病理改变、血清E_2、ER、P、PR、卵巢E_2、ER、P、PR、子宫E_2、ER、P、PR、FAP均有不同程度的抑制作用,但三棱-莪术组分配伍(1:1)高剂量组对子宫肌瘤有更好的抑制作用,该其药理作用机制可能是,同时抑制雌孕激素、雌孕激素受体以及成纤维细胞活化蛋白的表达。此外,实验结果表明大鼠子宫组织中的雌激素与成纤维细胞活化蛋白的表达呈现一定程度的正相关关系,我们推测成纤维细胞活化蛋白的高表达可能是由过荷的雌激素刺激造成的。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

外观图,大鼠,空白,莪术

图 1 为造模后大鼠外观图。注：A 为空白组大鼠，B、C、D 为其他组外观改变较典型的大鼠3.2 三棱-莪术药物及组分配伍对大鼠子宫外观的影响空白组（图 2-A），可见两侧子宫左右对称，呈 Y 形，横竖径正常，质地均

水煎液,低剂量,空白

图 2 为各组大鼠子宫大体观。注：A：空白组；B：模型组；C：阳药组；D：S-E 1：1 高剂量组；E：S-E 1：1 中剂量组；F：S-E 1：1 低剂量组；G：S-E 1：2 组；H：S-E 2：1 组；I：S 组；J：E 组；K：S-E 水煎液组

病理切片,肌纤维,空泡变性,水煎液

可见少量粘膜上皮细胞空泡变性，肌纤维稍有增厚；S-E 1：2 组（图3-G），可见粘膜上皮细胞空泡变性，肌层少量炎性细胞浸润，肌纤维排列紊乱；S-E 2：1 组（图 3-H），可将肌纤维排列紊乱，稍有增厚，肌间炎性细胞浸润，偶见少量粘膜上皮细胞空泡变性；S 组（图 3-I），可见肌纤维稍有增厚，少量粘膜细胞水肿，肌间稍有炎性细胞浸润；E 组（图 3-J），可见肌纤维排列紊乱，肌间炎性细胞浸润，黏膜上皮细胞空泡变性；S-E 水煎液组（图 3-K），可见肌纤维排列紊乱，偶见少量细胞水肿、充血，偶见少量炎性细胞浸润。图 3 为各组大鼠子宫病理切片（ 200）。注：A：空白组；B：模型组；C：阳药组；D：S-E 1：1 高剂量组；E：S-E 1：1 中剂量组；F：S-E 1：1 低剂量组；G：S-E 1：2 组；H：S-E 2：1 组；I：S 组；J：E 组；K：S-E 水煎液组

【参考文献】