珍宝丸在脊髓损伤再生修复中的作用及相关机制研究

发布时间：2020-08-05 08:14

【摘要】：背景脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是临床常见疾患,致残率高,远期缺乏有效治疗的药物。本课题基于多年珍宝丸临床治疗经验及前期实验研究发现,含珍珠层,蟾蜍,麝香,羚羊的珍宝丸对脊髓损伤(SCI)有良好的治疗作用。然而,其修复脊髓损伤的复杂机制尚不清楚,脊髓损伤中各种复杂的分子机制还不是十分明确,还需要进一步的探讨及研究,本文从珍宝丸入手,使用脊髓损伤的大鼠模型进行研究,以期得到珍宝丸在脊髓损伤再生修复中的作用和相关机制。第一部分珍宝丸通过上调HSP27减少Treg细胞缓解大鼠脊髓损伤目的本研究旨在探讨CD4 + CD25 + Foxp3 +调节性T细胞(Tregs)在珍宝丸修复脊髓损伤作用机制中的作用,进一步探讨Tregs与HSP27在修复机制中的关系。方法用珍宝丸不同浓度(0,0.5,2.5,5,10mg/mL)处理人外周血单个核细胞(PBMCs),流式细胞仪检测Tregs中特异性因子CD4 + CD25 + Foxp3 +的表达,用ELISA测定检测Tregs相关调节因子TGF-β含量。荧光素酶法检测miR-214与HSP27的关系,qR-PCR法检测miR-214的表达水平。qPCR和Western blotting检测HSP27的表达。采用RNA干扰技术和基因重组技术抑制和上调HSP27的表达。结果珍宝丸对Tregs的IC50为11.61mg/mL,可显着抑制人PBMCs分化成Tregs,并上调超过1倍的HSP27表达。基本上,它通过抑制miR-214表达(50%)来增强HSP27的表达。在人PBMCs中促进了 HSP27表达的抑制,随后分化成Tregs。当HSP27表达上调时,向Tregs的分化减少30%。这表明HSP27的表达调节了向Tregs的分化。抑制HSP27表达和珍宝丸治疗后,分化成Tregs的比例下降,但仍高于仅用药治疗组。在珍宝丸的作用下,HSP27的表达没有完全干扰,其表达水平仍然增加。结论在脊髓损伤再生修复的过程中,珍宝丸通过诱导HSP27表达来抑制Treg细胞数量和降低TGF-β的水平。第二部分珍宝丸通过调节GPR17表达的miR-146a-5p防止急性脊髓损伤目的本研究旨在观察珍宝丸对急性脊髓损伤(ASCI)大鼠运动功能的影响,以及miR-146a-5p和G蛋白偶联受体17(GPR17)的分子机制。方法用Allen's法建立急性脊髓损伤的大鼠模型,将大鼠分为3组。将SH-SY5Y细胞在低氧条件下培养过夜并用miR-146a-5p模拟物或miR-146a-5p抑制剂转染。用(Basso,Beattie,Bresnahan,BBB)评分系统评估大鼠的后肢运动功能。实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)和 Western blot 检测 miR-146a-5p,GPR17,诱导型一氧化氮合酶(iNOS),白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。使用低细胞计数测定法测量神经元凋亡。进行萤光素酶报告基因测定以确定miR-146a-5p 对 GPR17 的调节。结果珍宝丸可增加miR-146a-5p的表达水平,降低GPR17的表达,生物信息学软件预测GPR17 3'-UTR与miR-146a-5p具有结合位点。荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-146a-5p对GPR17表达具有负调控作用。降低miR-146a-5p可逆转珍宝丸对缺氧诱导的GPR17上调的作用,逆转珍宝丸对缺氧诱导的细胞凋亡的抑制作用及增强珍宝丸对ASCI大鼠后肢运动功能的恢复。因此,珍宝丸能增强后肢运动功能,减轻急性脊髓损伤引起的炎症反应。结论珍宝丸可通过调节miR-146a-5p/GPR17表达来抑制神经细胞凋亡,进而促进脊髓功能恢复。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

脊椎,棘突,剃毛,三氯乙醛

根据预先建立的模型描述协议［５６］建立了邋ＳＣＩ模型。ＳＣＩ组大水合三氯乙醛（３ｍＬ／ｋｇ）腹部注射麻醉，俯卧位固定，胸背部剃毛备消毒，定位于Ｔ１０棘突位置，以此为中心作为背部正中切口，切开暴脊椎，在Ｔ］０棘突处进行２０ｓ脊椎挤压至脊髓损伤，缝合伤口，术后肢瘫痪，表明建模成功（图１Ａ－Ｆ）。正常组大鼠利用相同方法暴露脊

给药,神经,过程,大鼠

１．３分组逡逑治疗ＳＣＩ大鼠随机分为４组：对照组（ｎ＝１０）；珍宝丸０．２，邋０．４和０．８邋ｇ／ｋｇ逡逑组（ｎ＝１０），珍宝丸组大鼠口服珍宝丸（图２），每日１次，每日一次，共６周；逡逑对照组（ｎ＝１０）大鼠口服用赋形剂（０．５％羧甲基纤维素钠）给药。逡逑图２给药过程逡逑１．４神经评估逡逑每周使用珍宝丸治疗，使用（ｔｈｅ邋Ｂａｓｓｏ，邋Ｂｅａｔｔｉｅ邋ａｎｄ邋Ｂｒｅｓｎａｈａｎ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ逡逑ｓｃａｌｅ，ＢＢＢ）运动动能评分评估双后肢运动功能［５７］。如前所述［５８］，传感器电机逡逑栅格步行测试旨在检查大鼠精确控制后爪放置的功能。在ＢＢＢ测试中至少步态逡逑良好的大鼠不能进行人行道，并根据最大值进行分类。为了减少平均误差和提高逡逑准确性，所有的评估都采用双盲技术进行：两个人从不同的侧面观察，并独立记逡逑录得分，然后获得平均值。逡逑１．５细胞培养逡逑如前所述［５９］，从健康受试者的供体人血中制备人ＰＢＭＣ，并将分离的人逡逑ＰＢＭＣ储存在氮罐中。我们从氮罐中取出人类ＰＢＭＣ，并在３７°Ｃ迅速融化不超逡逑过１分钟。在无菌条件下

神经功能,大鼠,百分比,对照组

逡逑０．４或０．８邋ｇ邋／邋ｋｇ）处理组大鼠的脚步误差显着低于ＳＣＩ对照组（图３Ｂ）。ＳＣＩ逡逑后大鼠Ｔｒｅｇｓ百分比明显高于正常组。与ＳＣＩ对照组相比，Ｔｒｅｇｓ珍宝丸的百分逡逑比（０．２，邋０．４或０．８邋ｇ／ｋｇ）治疗组均有不同程度的下降。珍宝丸剂量在０．２－０．８邋ｇ逡逑／ｋｇ范围内，Ｔｒｅｇｓ百分比与浓度呈负相关（图３Ｃ）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑２０－ｎ逦８０－逡逑ＣＯ／７逦一逡逑？逦－＊？邋０．２＾邋ｇ邋％逡逑Ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｊｕｒｙ逦＾逦＾逦＾逡逑６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋Ｚｈｅｎｂａｏ邋ｐｉｌｌ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑＊＊逡逑Ｃ逦一逡逑＊逡逑１５－ｊ逦逡逑＿邋ｓ逡逑Ｉｆｔｌｌｕ逡逑６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋Ｚｈｅｎｂａｏ邋ｐｉｌｌ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑图３用不同剂量珍宝丸治疗ＳＣＩ大鼠后，评估神经功能。逡逑Ａ．

【参考文献】