大承气汤及其主要成分大黄素通过抑制NADPH氧化酶活性治疗重症急性胰腺炎的实验研究

发布时间：2020-08-05 08:14

【摘要】：目的:通过复制大鼠和小鼠重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)模型,探讨通里攻下经典方剂大承气汤及其主要成分大黄素对NADPH氧化酶的影响,并从氧化应激及炎症小体的方面研究其抗SAP的作用机制。方法:1.大承气汤对SAP大鼠NADPH氧化酶的抑制作用:SD大鼠24只,通过胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠法复制SAP大鼠模型,设置3组,分别为假手术组、SAP组、SAP+大承气汤组(大承气汤组),每组8只。造模后6h处死各组大鼠,于腹中线开腹,从腹主动脉抽取血液样本,并收取胰腺组织。ELISA法检测血液样本上清中Amy、IL-1、IL-1β和TNF-α水平,以及胰腺组织匀浆中氧化应激指标SOD、MDA、GSH-PX水平;大鼠胰腺组织切片后,HE染色并进行相应的病理评分;Western blot及免疫组织化学法检测NLRP3、NADPH oxidase 2(NOX2)及NOX的主要结构亚型P22和P47蛋白在胰腺组织中的表达水平。2.大黄素通过抑制NADPH氧化酶治疗SAP小鼠的实验研究:在雨蛙素+LPS诱导小鼠SAP模型基础上,设置对照组、SAP组、SAP+大承气汤组(大承气汤组)、SAP+大黄素组(大黄素组)及SAP+DPI组(DPI组,DPI为NADPH氧化酶抑制剂),每组8只,各组小鼠于造模后12h处死,小鼠眼眶取血,并取胰腺组织。应用ELISA试剂盒检测血清中Amy、IL-1、IL-1β和TNF-α水平,试剂盒检测胰腺组织匀浆后氧化应激指标SOD,MDA,GSH-PX的水平;小鼠胰腺组织切片后进行HE染色并病理评分;Western blot及免疫组织化学法检测胰腺组织NLRP3、NOX2、P22和P47等蛋白的表达情况。结果:1.大承气汤对SAP大鼠NADPH氧化酶的抑制作用:相较假手术组,SAP组大鼠血清指标Amy、IL-1、IL-1β和TNF-α水平显著升高;胰腺氧化应激指标中,SAP组MDA水平明显升高,而SOD、GSH-PX水平明显降低;大承气汤可以显著降低SAP组升高的MDA,升高SAP组降低的SOD、GSH-PX水平(P0.05)。HE结果提示:SAP组胰腺组织较假手术组有明显的出血、坏死和炎性细胞浸润,大承气汤可以明显改善胰腺组织的病理改变,降低SAP胰腺组织的病理评分(P0.05);Western blot法检测胰腺组织相关蛋白表达,结果显示:SAP组大鼠胰腺NLRP3、NOX2、P22和P47蛋白水平较假手术组显著升高(P0.05),大承气汤可显著下调SAP的上述指标(P0.05),免疫组化结果也同样检测到SAP组目标蛋白阳性表达水平的升高以及大承气汤对其的抑制作用(P0.05)。2.大黄素通过抑制NADPH氧化酶治疗SAP小鼠的实验研究:与对照组相比,SAP组小鼠血清指标Amy、IL-1、IL-1β和TNF-α及胰腺组织氧化应激指标MDA数值显著升高,SOD、GSH-PX水平下降,大承气汤组、大黄素组、DPI组较SAP组Amy、IL-1、IL-1β、TNF-α和MDA水平降低(P0.05),SOD、GSH-PX水平明显升高(P0.05);HE结果显示:SAP组胰腺组织较对照组有明显的炎症和坏死性改变,大承气汤组、大黄素组、DPI组胰腺病理变化均较SAP组有所改善,病理评分显著降低(P0.05);Western blot法检测小鼠胰腺组织NLRP3、NOX2、P22和P47蛋白,SAP组水平均较对照组显著升高(P0.05),大承气汤组、大黄素组、DPI组SAP组的上述数据有所下降(P0.05);大承气汤组、大黄素组,DPI组三组蛋白表达水平差异不大(P0.05);免疫组化实验也进一步证实了与western blot结果趋势一致的蛋白表达水平的改变。结论:1.大承气汤可以降低SAP大鼠胰腺NADPH氧化酶的表达以及氧化应激的水平,降低SAP大鼠炎症因子,减轻胰腺损伤。2.大承气汤及其主要成分大黄素可以通过抑制NADPH酶的表达,降低机体炎症因子及炎症小体NLRP3的表达水平,进而改善SAP。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

血清,淀粉酶,氧化应激,指标检测

22图 1：血清 TNF-α、淀粉酶、IL-1 及 IL-1β 水平Fig 1: TNF-α, amylase, IL-1 and IL-1β levelsA：血清 TNF-α 水平（ng/ml） B：血清 AMY 水平（U/L）C：血清 IL-1 水平（pg/L）D：血清 IL-1β 水平（pg/ml）；与假手术组即 Ctrl 组比较▲▲P<0.01; 与 SAP 组比较△P <0.052.2 胰腺组织氧化应激指标检测SAP 组氧化应激水平较假手术组升高（MDA 升高，SOD 和 GSH-PX 下降，（P<0.01），DCQT 组大鼠胰腺组织氧化应激相关的指标 SOD、GSH-PX 较 SAP 组升高（P<0.05），而 MDA 下降（P<0.01），表明 DCQT 可以有效降低 SAP 大鼠的氧化应激水平（图 2）。

匀浆,胰腺

图 2：胰腺匀浆 MDA、SOD、GSH-PX 水平Fig 2: SOD, GSH-PX, MDAlevels in rat pancreatic tissueA：胰腺组织 MDA 水平（nmol/mg）B：胰腺组织 SOD 水平(U/mg)C：胰腺组织中的 GSH-PX 水平(U/mg)与 Ctrl 组比较▲▲P <0.01;与 SAP 组比较△P <0.05，△△P <0.012.3 大鼠胰腺组织病理改变显微镜下观测可见假手术组大鼠胰腺结构较为完整，没有炎性细胞浸润；SAP组大鼠腺泡完整度不在，伴大量炎性细胞浸润，周围出血，并可见大片状坏死；DCQT 组较 SAP 组胰腺病理变化明显改善。HE 组织切片结果表明 DCQT 应用后表现出对胰腺组织的保护作用（图 3）。

胰腺,相关蛋白,大鼠,病理学

图 3：大鼠胰腺组织病理改变（HE×200）Fig 3: Pathological changes in rat pancreas（HE×200）A：Ctrl 组胰腺 HE 切片 B：SAP 组胰腺 HE 切片 C：SAP + DCQT 组胰腺 HE 切片 D：胰腺水肿评分 E：胰腺组织的坏死评分 F：胰腺组织的出血评分 G：胰腺组织炎症评分 H：胰腺组织病理学总分；与 Ctrl 组比较▲▲P <0.01;与 SAP 组相比△P <0.05，△△P<0.012.4 胰腺组织蛋白 Westernblot 检测结果为了探究 DCQT 对 SAP 大鼠 NADPH 氧化酶相关蛋白表达水平的影响，我们检测了胰腺组织 NLRP3、NOX2、P22、P47 蛋白的表达，结果表明，SAP 组胰腺组织 NLRP3、NOX2、p47 和 p22 蛋白表达明显高于 SAP 组（P<0.01），应用 DCQT可降低了 SAP 大鼠上述相关蛋白水平的表达（P<0.05）（图 4）。

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