盐酸千金藤碱对人卵巢癌的作用及其机制的研究

发布时间：2020-08-05 12:46

【摘要】：卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,由于早期很难发现,患者因出现临床症状而就诊时,往往肿瘤已对周围组织器官造成侵袭,出现盆、腹腔内的浸润与转移。化疗是卵巢癌的重要治疗手段,卵巢癌的临床化疗方案以铂类和紫杉醇为主导,化疗初始时约有80%的患者显示治疗有效,然而多数患者很快就会因肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)的出现而使治疗效果受到严重影响。卵巢癌易于侵袭转移和易于产生MDR的特点,使其成为临床上预后最差的妇科肿瘤,在充分治疗的情况下,五年生存率仍低于45%,因此,研发、寻找更为有效的治疗药物,尤其是寻找在抑制肿瘤生长的同时,还能抑制肿瘤侵袭或逆转肿瘤MDR的药物,对卵巢癌的治疗具有重大意义。本室参与研制的盐酸千金藤碱(cepharanthine hydrochloride,CH),是经由千金藤属植物头花千金藤中提取的千金藤素(cepharanthine,CEP)盐化而得到的半合成化合物。多个研究证明,CEP在某些类型的肿瘤中可以表现出直接的抗肿瘤活性,也可以抑制某些肿瘤细胞的侵袭和转移,另外有研究证实CEP可以有效地增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,而CEP或CH对卵巢癌相关方面的作用在国内外尚未见报道。为了探索CH对卵巢癌的作用,我们选取上皮来源的卵巢癌耐紫杉醇且具有MDR表型的A2780/Taxol细胞株和其亲本的A2780细胞株为模型,采用多种实验技术研究了CH对卵巢癌的增殖、凋亡、迁移和多药耐药性的影响及其作用机制,以求扩大CH可能的临床适应证,为其进一步开发提供理论和实验依据。根据涉及内容的相关性,本研究可以分成以下两个部分:第一部分盐酸千金藤碱对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制的研究目的:本部分以卵巢癌A2780细胞为受试对象,旨在研究CH对A2780细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其相关机制。方法:采用MTT法检测不同浓度的CH作用于A2780细胞72 h的增殖抑制率,并求得IC_(50);采用MTT法检测以IC_(50)浓度的CH作用于A2780细胞24 h、48 h、72 h和96 h的增殖抑制率;采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法,通过流式细胞仪检测CH对A2780细胞凋亡的影响;采用划痕实验检测CH对A2780细胞迁移能力的影响;采用Transwell实验检测CH对A2780细胞侵袭能力的影响;采用RT-qPCR实验检测CH对A2780细胞Bcl-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平的影响。结果:1.CH对A2780细胞的增殖抑制,随着浓度的增加(1.25、2.5、5、10、20、40和80μM)和作用时间的延长(24、48、72和96 h),MTT结果显示抑制率逐渐增大;CH作用于A2780细胞72 h的IC_(50)为30.21±1.24μM。2.CH以不同浓度(2、4、8μM)作用于A2780细胞48 h后,流式细胞仪凋亡检测显示,与对照组相比,细胞晚期凋亡呈浓度依赖性增加(8.5±1.7%、12.0±1.0%、14.3±2.1%v.s.2.9±0.7%,p0.01)。3.CH以8μM的浓度作用于A2780细胞不同时间(24、48 h)后,划痕实验结果显示,与对照组相比,细胞划痕愈合率显著降低(3.8±2.5%v.s.33.3±5.7%,7.1±1.8%v.s.43.5±1.2%,p0.01)。4.CH以不同浓度(2、4、8μM)作用于A2780细胞48 h后,Transwell检测显示,与对照组相比,穿透基底膜进入小室下层的细胞数呈浓度依赖性减少(79.6±3.6、68.2±3.1、68.2±3.1 v.s.101.4±4.9个,p0.01),CH对A2780细胞的侵袭抑制率呈浓度依赖性增加(21.5±3.6%、32.7±3.1%、43.0±2.6%)。5.CH以不同浓度(2、4、8μM)作用于A2780细胞48 h后,RT-qPCR检测显示,Bcl-2、MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平均呈浓度依赖性降低。小结:本部分研究表明,CH能够抑制卵巢癌A2780细胞的增殖,并且其抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性;CH能够浓度依赖性地促进A2780细胞发生晚期凋亡,而对早期凋亡无显著影响,其机制可能和抑制凋亡的关键调节基因Bcl-2的表达相关;CH能够抑制A2780细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能和抑制迁移的关键调节基因MMP-2和MMP-9的表达相关。第二部分盐酸千金藤碱对人卵巢癌细胞多药耐药的逆转及其机制的研究目的:本部分以卵巢癌耐药细胞A2780/Taxol和其亲本的A2780细胞为受试对象,旨在研究CH对A2780/Taxol细胞MDR的逆转作用及其相关机制。方法:采用MTT法检测不同浓度的紫杉醇作用于A2780/Taxol细胞和A2780细胞72 h的增殖抑制率,求得IC_(50)同时计算耐药倍数;采用MTT法检测梯度浓度的紫杉醇单独及其与CH共同作用于A2780/Taxol细胞72 h的增殖抑制率,并计算IC_(50)和逆转倍数;采用罗丹明蓄积实验,通过流式细胞仪检测并比较A2780/Taxol细胞和A2780细胞的罗丹明123(Rhodamine 123,Rho-123)的蓄积能力;采用罗丹明蓄积实验,通过流式细胞仪检测CH对A2780/Taxol细胞P-gp功能的影响;采用RT-qPCR法检测CH对A2780/Taxol细胞MDR1 mRNA表达水平的影响;采用Western blot法检测不同浓度CH对P-gp表达水平的影响;采用Western blot法检测不同浓度CH对总Akt和磷酸化Akt表达的影响,考察CH对Akt磷酸化的调节作用;采用Western Blot法检测CH单用及与PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002合用后A2780/Taxol细胞中P-gp表达的变化,考察CH对A2780/Taxol细胞PI3K/Akt通路的影响。结果:1.紫杉醇对卵巢癌耐药株A2780/Taxol细胞和敏感株A2780细胞作用72 h的IC_(50)分别为1475.0±22.6和39.5±2.8 ng/ml;A2780/Taxol细胞的耐药倍数为37.3。2.罗丹明蓄积实验显示,A2780/Taxol细胞的Rho-123蓄积能力显著高于A2780细胞(25.1±3.1%v.s.2.6±1.1%,p0.01)。3.RT-qPCR实验显示,A2780/Taxol细胞MDR1 mRNA的表达水平显著高于A2780细胞。4.梯度浓度的紫杉醇单独或者与不同浓度(2、4、8μM)的CH共同作用于A2780细胞72 h后,MTT法检测显示,与紫杉醇单用组相比,CH紫杉醇合用组IC_(50)呈浓度依赖性降低(688.0±7.9、478.3±9.6、185.7±6.5 v.s.1475.0±22.6 ng/ml,p0.01),CH的逆转倍数呈浓度依赖性增加(2.1、3.1、7.9)。5.CH以不同浓度(2、4、8μM)处理A2780/Taxol细胞2 h后,罗丹明蓄积实验检测显示,与未处理组相比,CH处理组Rho-123的蓄积呈浓度依赖性升高(13.8±2.2%、17.5±1.0%、23.1±2.1%v.s.2.6±1.1%,p0.05)。6.CH以不同浓度(2、4、8μM)作用于A2780/Taxol细胞48 h后,RT-qPCR实验显示,MDR1 mRNA的表达水平呈浓度依赖性降低。7.CH以不同浓度(2、4、8μM)作用于A2780/Taxol细胞48 h后,Western blot实验显示,P-gp的表达水平呈浓度依赖性降低,总Akt蛋白的表达不变,磷酸化Akt蛋白呈浓度依赖性降低。8.CH与PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002共同作用后,与CH单独作用或LY294002单独作用相比,P-gp表达的下调显著加强。小结:本部分研究表明,CH能够浓度依赖性地逆转卵巢癌耐药株A2780/Taxol细胞的MDR,使其对紫杉醇的敏感性大大增加;CH能够浓度依赖性地抑制A2780/Taxol细胞的P-gp功能,使其药物转运泵的作用大大下降;CH能够浓度依赖性地抑制A2780/Taxol细胞MDR1 mRNA的表达、P-gp的表达和磷酸化Akt的表达;CH逆转卵巢癌耐药的机制可能涉及对Akt磷酸化的抑制降低了PI3K/Akt信号通路的活性,从而抑制了P-gp的表达。全文结论1.CH能够显著抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制可能和抑制凋亡和迁移的关键调节基因Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达相关。2.CH通过抑制P-gp的表达和功能,逆转卵巢癌的多药耐药。3.CH通过抑制Akt的磷酸化来抑制PI3K/Akt信号通路的活性,从而达到其逆转P-gp介导的卵巢癌耐药的作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

盐酸,化学结构,胆管癌细胞

分盐酸千金藤碱对人卵巢癌细胞增殖、侵袭能力的影响及的生物学性质，包括抗炎、抗病毒和抗过敏活性[30]各种药理学作用而引起了研究人员额外的关注。研腹水瘤和胆管癌细胞的增殖，直接发挥其抗肿瘤活G-63 细胞的迁移和侵袭能力[33]；可以引发人肝癌细的凋亡。此外多项研究证实，CEP 可以有效地增强性，并抑制人膀胱癌细胞[35]，肝癌细胞[36]、胆管癌细胞[37]中的 P-gp 表达。EP 在肿瘤治疗领域的光明前景，本实验室联合中科学生物医药研究开发基地，以天然单体化合物 CEP 其水溶性和疗效，研制出半合成化合物盐酸千金藤碱de，CH），其化学结构如下图所示。

曲线,卵巢癌,抑制率,细胞

表 1.1 MTT 法检测不同浓度的 CH 对卵巢癌 A2780 细胞的抑制率le 1.1 The inhibition rate of A2780 treated with different concentration of CH bayConcentration of CH (μM) Inhibitory rate (%)80 96.36±1.3440 79.57±3.4020 49.16±2.5410 29.24±3.665 20.23±0.872.5 15.57±5.061.25 2.71±2.00IC5030.21±1.24 μM验数据用三次重复实验的均数±标准差来表示。ata were expressed as mean ± SD of triplicate experiments.

曲线,抑制率,卵巢癌,细胞

第一部分盐酸千金藤碱对人卵巢癌细胞增殖、侵袭能力的影响及其作用机制Figure 1.1 The curve of the inhibiton of A2780 treated with CH for 72 h. were expressed as mean ± SD of triplicate experiments.为了考察 CH 对 A2780 细胞的增殖抑制和作用时间的关系，根据上一步实验结果，我们选取接近 CH 的 IC50浓度 30 μM，进一步检测加入 CH 后持作用不同时间（24、48、72 和 96h）对 A2780 细胞的增殖抑制。结果如图所示，不同组间对 A2780 细胞的抑制率具有显著性差异，并且随着 CH 作用间的延长，对 A2780 细胞的抑制率逐步增大，表明 CH 对 A2780 细胞的抑制用具有时间依赖性。

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