雷公藤红素对小鼠腹腔巨噬细胞极化分型的影响及其机制的初步探索

发布时间：2020-08-06 09:45

【摘要】：目前,代谢性疾病已成为世界范围内最常见的、对人们健康构成主要威胁的一类非传染性疾病。尽管代谢性疾病的许多确切机制尚不清晰,大量的研究表明过度激活的炎症反应是重要的病因之一。巨噬细胞等免疫细胞的炎性浸润构成了炎性反应环境的主要特点。表型/功能的可塑性和异质性是巨噬细胞的两个主要特征一一巨噬细胞在应对相应细胞外环境刺激时可分别活化成促炎的经典活化M1型巨噬细胞和抗炎的替代活化M2型巨噬细胞。巨噬细胞表型的差异调节对这些代谢性炎症疾病的进展有着深远的影响。雷公藤红素(celastrol)是从原产于中国南方的多年生匍匐植物雷公藤的根皮中分离出的一种天然五环三萜类醌甲基化合物,已经在几种动物实验模型中表现出了有效的抗炎作用,因此一般被用于治疗慢性炎症、自身免疫性疾病和神经退行性疾病。但雷公藤红素是否能通过调节小鼠腹腔原代巨噬细胞的极化分型来发挥抗炎作用仍需我们进一步探索。Sirtl(Silent mating type information regulation 2 homolog 1)是调节代谢的进化上高度保守的NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶,最近的研究已确定其在多个组织糖脂代谢中的关键地位。我们实验室前期的研究表明,雷公藤红素能通过促进Sirt1的过表达改善小鼠由于高脂饮食引起的炎症等肝脏代谢损伤。血红素加氧酶(Heme oxygenase,HO)是血红素分解代谢的关键酶,它有三种类型的同工酶,HO-1(氧应激诱导型)、HO-2(组成型)和HO-3(尚未明确)。其中,HO-1已被证实在抗氧化防御、抗炎和抗凋亡方面具有重要作用。我们实验室之前的研究发现,Sirt1的过表达诱导了 HO-1的表达,从而发挥了抗氧化的作用。那么雷公藤红素能否通过Sirt1和HO-1调节巨噬细胞的极化从而发挥抗炎作用改善代谢损伤呢?本课题就这一问题进行了以下实验。我们首先利用实验室留存的 WT(ND/HFD;con/cel)和 Sirtl-/(ND/HFD;con/cel)小鼠肝组织进行了预实验一一将上述肝组织提RNA后,用qRT-PCR技术检测了巨噬细胞极化分型相关基因的转录水平,结果发现,雷公藤红素能使WT小鼠肝组织M2型巨噬细胞相应标志物的mRNA水平极大提高,但Sirtl-/-小鼠肝组织M2型巨噬细胞相应标志物的mRNA表达均下降。这一结果说明雷公藤红素对巨噬细胞的极化分型有影响,且其机制很可能与Sirtl基因有关。接着,我们以灌肉汤法(刺激法)分离的小鼠腹腔巨噬细胞为主要研究对象,分别用qRT-PCR技术和流式细胞术检测了对照组(con)、单纯雷公藤红素干预组(cel)、经典激活Ml组(IFN-y+LPS)和雷公藤红素干预M1组(IFN-y+LPS+cel)四组细胞中M1型和M2型巨噬细胞相关标志物的表达——qRT-PCR实验结果显示,雷公藤红素引起M1型巨噬细胞相应标志物CD11c、iNOS表达减少,使M2型巨噬细胞相应标志物Arg-1表达增加;流式细胞术实验结果显示,雷公藤红素能使F4/80+CD11c+ M1型巨噬细胞和CD11c+CD206-M1型巨噬细胞的比例均下降。这些实验结果说明,雷公藤红素能抑制小鼠腹腔巨噬细胞向M1型极化。之后的实验结果显示,Sirt1抑制剂EX-527组的M2型巨噬细胞相关标志物mRNA表达减少,EX-527干预雷公藤红素组的M1型巨噬细胞的比例增加。此外,Western blot实验结果显示,在刺激法分离的小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7中,雷公藤红素均能促进Sirt1蛋白和HO-1蛋白的表达。在我们用分化成熟的3T3-L1脂肪细胞和小鼠单核巨噬细胞株Raw264.7构建的脂肪组织炎症模型中,雷公藤红素也能促进Sirt1和HO-1的蛋白表达,且给予EX-527后,Sirt1和HO-1的蛋白表达均下降。上述结果均表明,雷公藤红素可能通过Sirt1和HO-1调节小鼠腹腔巨噬细胞的极化分型。这一结果对改善巨噬细胞炎性浸润环境有一定的启发和意义。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

图３．各处理组Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ型巨噬细胞比例的比较逡逑Ｆｉｇ．３．邋Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｇｒｏｕｐｓ．邋Ｗｅ邋ｕｓｅ邋ＡＰＣ邋ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ邋Ｆ４／８０邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ａｎｄ邋ＰＥ邋ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ邋ＣＤｌｌｃ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｔｏ逡逑ｍａｒｋ邋Ｍｌ邋ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ａｓ邋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１邋ｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．邋（Ａ）邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ邋／邋Ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋（Ｂ）邋Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１邋ｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑ｇｒｏｕｐ．邋（Ｃ）邋Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｃｅｌａｓｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．邋Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ逡逑ｄｅｃｒｅａｓｅｓ邋ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃｆ邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．邋（Ｄ）邋Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｏｆ邋ＩＦＮ－ｙ＋ＬＰＳ邋ｇｒｏｕｐ．邋（Ｅ）邋Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋逡逑Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｏｆ邋ＩＦＮ－ｙ＋ＬＰＳ＋ｃｅｌ邋ｇｒｏｕｐ邋（ａｌｓｏ邋ｋｎｏｗｎ邋ａｓ邋ｃｅｌａｓｔｒｏｌ邋ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ逡逑Ｍｌ邋ｇｒｏｕｐ）．邋Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ邋ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋Ｍｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｄｅｃｒｅａｓｅｓ邋ｐｒｏｐｏ

图４．各处理组ＣＤｌｌｃ＋ＣＤ２０６－?

图５．邋Ｓｉｒｔｌ抑制剂ＥＸ－５２７对小鼠腹腔巨噬细胞极化分型的影响逡逑Ｆｉｇ．５．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＥＸ－５２７邋（Ｓｉｒｔｌ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）邋ｏｎ邋ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ逡逑ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ．邋ｑＲＴ－ＰＣＲ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｄｅｔｅｃｔ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｍＲＮＡ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋Ｍ２邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ逡逑ｔｙｐｉｃａｌ邋ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ邋ｉｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ａｎｄ邋ＥＸ－５２７邋ｇｒｏｕｐ．邋Ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｄｅｔｅｃｔ逡逑Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＾邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｉｎ邋ｃｅｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｃｅｌ＋Ｅｘ－５２７邋ｇｒｏｕｐ，邋ｔｈｕｓ邋ｗｅ邋ｃａｎ逡逑ｃｏｍｐａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｆ４／８０＋ＣＤｌｌｃ＋邋Ｍｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ邋ｉｎ邋ｂｏｔｈ邋ｇｒｏｕｐｓ．邋Ｂｏｔｈ逡逑ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ邋ａｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ邋ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＥＸ－５２７邋（Ｓｉｒｔｌ邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）邋ｏｎ邋ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ逡逑ｏｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ．邋（Ａ）邋ＥＸ－５２７邋ｇｒｏｕｐ邋ｓｈｏｗｓ邋ａ邋ｔｒｅｎｄ邋ｏｆ邋ｄｅｃｒｅａｓｅｄ邋Ａｒｇ－１逡逑ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；邋ＥＸ－５２７邋ｄｅｃｒｅａｓｅｓ邋ＣＤ２０６邋ｎｉＲＮＡ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ；邋ＥＸ－５２７邋ｇｒｏｕｐ逡逑ｓｈｏｗｓ邋ａ邋ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ邋ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩＬ－１０邋ｍ

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本文编号：2782198