夏枯草提取物对间变性大细胞淋巴瘤的作用及分子机制的研究
发布时间：2020-08-06 12:54
【摘要】：研究背景及目的:淋巴瘤是一类原发于淋巴结和(或)结外淋巴组织的恶性肿瘤,病理可见分化、成熟程度不一的肿瘤性淋巴细胞大量增生,侵犯全身各个部位或组织。临床以无痛性,进行性淋巴结肿大为主要表现。常伴有发热、盗汗、消瘦、肝脾大,晚期有贫血、恶病质等临床表现。近年研究发现,淋巴瘤发病率有逐年上升的趋势,在全部肿瘤患者中所占的比例大约是5%,其中非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma,NHL)占恶性淋巴瘤的89.1%,约为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma,HD)的7倍。非霍奇金淋巴瘤高发病区为西欧、美国及中东,而中国、日本等为低发病区。在我国,每10.0万人中有286人患癌,恶性淋巴瘤的发病率也不断增加,逐渐成为威胁国民健康的一类主要的肿瘤。而在欧洲、美洲和大洋洲,恶性淋巴瘤的发病率可高达18/10万,略高于各类白血病的总和。在美国,恶性淋巴瘤每年新增患者3.0万以上。我国恶性淋巴瘤的死亡率为1.5/10.0万,占所有恶性肿瘤死亡位数的第10-14位,与白血病比较相仿。从发病趋势来看,霍奇金淋巴瘤趋于稳定,而非霍奇金淋巴瘤在发达国家有上升趋势。本病可发生于任何年龄,但发病年龄高峰在31-40岁,其中NHL高峰略往前移。男女之比为:2-3:1。一般认为,可能和基因突变,以及病毒及其他病原体感染、放射线、化学药物,合并自身免疫病等有关。恶性淋巴瘤是具有相当异质性的一大类肿瘤,虽然好发于淋巴结,但是由于淋巴系统的分布特点,使得淋巴瘤属于全身性疾病,几乎可以侵犯到全身任何组织和器官。因此,恶性淋巴瘤的临床表现既具有一定的共同特点,同时按照不同的病理类型、受侵部位和范围又存在着很大的差异。T细胞淋巴瘤常以结外病变居多并且在活检组织中常见坏死、凋亡,T细胞淋巴瘤的疗效和预后较B细胞淋巴瘤差,因此对于T细胞淋巴瘤的分子学机制的进一步研究及对其预后的更精确的评估显得尤为重要。间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic Large Cell Lymphoma,ALCL)是 2008 年WHO分类确立的独立类型。它是一种相对少见的、侵袭性较强的成熟的T细胞淋巴瘤,分为ALK阳性和ALK阴性。ALK阳性的间变性大细胞淋巴瘤占成人非霍奇金淋巴瘤的3%,占儿童非霍奇金淋巴瘤的10%-20%,发病年龄多在35岁之前,男性多见。本病的发病机制可能与遗传学的异常有关。ALK介导的肿瘤基因t(2;5)即2p23上ALK基因易位至5q35的NPM(核磷酸蛋白),形成NPM-ALK融合基因,激活酪氨酸激酶配体而高表达NPM-ALK嵌合蛋白。这可能是ALCL成瘤的关键机制。包括Bcl-2增加、过甲基化作用、c-myc表达等。由于该病有较高的EBV抗原和EBV-DNA/RNA的表达,有学者认为其发病与EB病毒感染有关,但尚有争议。根据美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南,间变性大细胞淋巴瘤的治疗以化疗为主,辅助以放疗、手术、干细胞移植等联合治疗。疾病早期主张先化疗后行病灶部位局部放疗,中晚期则以化疗为主。ALK阳性的患者就诊时大多已经是晚期,常伴有外周或腹部淋巴结肿大,也可见结外累及,包括皮肤、骨、软组织、肺、肝脏、骨髓,但肠道及中枢神经受累较少见。通常伴随B症状,特别是高热,霍奇金淋巴瘤样的ALCL也属于ALK阳性的ALCL,多发生于年轻人,发生纵膈累及的概率比较高,发病时多处于Ⅱ期,皮肤和骨骼累及少见。大部分病人ALK蛋白阳性、PAX-5阴性。目前治疗上采取以化疗为主,据统计我国ALK阳性的ALCL5年生存率约40%,复发率约30%,对局部复发的患者可以考虑在化疗的基础上加上局部放疗,对复发难治的患者,对选择与原来治疗方案无交叉耐药的二线方案。因此目前寻求高效低毒的抗肿瘤药物是当今ALCL治疗的主要研究内容之一。中药治疗肿瘤在我国己有悠久历史。通过临床应用证明,中草药治疗恶性肿瘤不但对化疗和放疗有着减毒、增效、增敏的效应;而且还具有预防肿瘤复发转移的作用,阻断癌前病变及抗肿瘤的作用。中草药在治疗肿瘤的同时,还可以提高机体的免疫力,对人体自身正常的细胞不会有破坏作用,这是许多化疗药物所不具备的效果;同时中草药还没有明显毒副反应、药源分布广泛、价廉、适宜长期应用等优点,是恶性肿瘤综合治疗中常用的有效手段之一。夏枯草具有清肝、明目、散结、消肿、止痛之功效。用于目赤肿痛、目珠夜痛、羞明流泪、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛。目前临床上多用于治疗甲状腺肿大、淋巴结核、乳腺增生、高血压、肺结核、急性黄疸型传染性肝炎及细菌性痢疾等疾病。夏枯草含有丰富的化学成分,主要成分有:三萜类、甾体类、黄酮类、香豆素类、有机酸类、糖类、挥发油类、其他等。有关夏枯草抗肿瘤作用有较多的报道,例如应用夏枯草治疗甲状腺癌、淋巴肉瘤、腮腺癌、扁桃腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌等由来已久。综上所述,夏枯草抗肿瘤活性的研究和作用机制的探讨有着极大的科研价值及应用前景。但是,目前,关于夏枯草抗肿瘤活性的研究仍然集中在粗提物,提取有效的抗肿瘤单体基本上是一片空白,并且,经文献检索国内外有关夏枯草体内抗淋巴系统恶性肿瘤的实验报道很少。人类研究肿瘤目前已经达到基因组学、蛋白质组学、代谢组学、表观遗传学的水平,基因组计划全基因组测序的完成,标志着后基因组时代的到来,人们对蛋白质研究的兴趣越来越浓,蛋白质组学研究也因此而有了飞快的发展。蛋白质组学的研究在肿瘤防治领域具有重要作用,其在肿瘤发病机理的阐明,肿瘤的早期诊断、肿瘤的临床治疗、肿瘤的预后以及抗肿瘤药物的开发上均显示出光辉的应用前景。代谢组学(metabonomics/metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想,对生物体内所有代谢物进行定量分析,并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式,是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化(DNAmethylation),基因组印记(genomic imprinting),母体效应(maternal effects),基因沉默(gene silencing),核仁显性,休眠转座子激活和RNA编辑(RNAediting)等。蛋白质作为生命存在的物质基础,是细胞代谢和调控途径的主要执行者,也是多种致病因子和大多数药物作用的靶分子。由于任何疾病在病理变化及临床治疗前后,细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变,所以,从理论上说,通过对蛋白质的动态检测,可以检测出疾病早期及临床治疗前后蛋白质质和量的变化,以作为疾病早期诊断、疗效评估及预后评估的指标。经过我们团队近11年的研究,在体外实验中,为了研究夏枯草提取物对淋巴瘤的作用,我们首先采用体外实验鉴定夏枯草提取物对不同淋巴瘤细胞系的作用效果,我们使用夏枯草提取物分别作用于T细胞淋巴瘤Karpas299、Jurkat、HUT78细胞系,观察对T细胞淋巴瘤的抗增殖效果,发现这三者中,karpas299疗效最好,从而选择了间变大细胞淋巴瘤Karpas299细胞系作为研究对象。进一步研究夏枯草提取物对细胞周期、细胞凋亡等的影响,采用TMT相对定量蛋白质组学技术鉴定夏枯草提取物作用Karpas299淋巴瘤细胞株的差异蛋白分子,其中发现表达明显的下调蛋白转录因子c-Jun和cyclin-D3,上调蛋白TNFα,它们能够诱导或抑制一组具有潜在肿瘤的相关基因,根据筛选的结果采用Western blot进一步验证差异蛋白及相关蛋白的功能及机制,采用代谢组学技术鉴定夏枯草提取物作用Karpas299淋巴瘤细胞株的差异代谢产物,筛选寻找夏枯草提取物作用Karpas299淋巴瘤细胞株的可能作用机制。为了进一步验证夏枯草提取物的疗效,我们使用BALB/c裸鼠成功构建了 Karpas299淋巴瘤动物模型,并观察夏枯草提取物在体内的作用效果,根据蛋白质组学的结果,采用Western Blot研究关键蛋白及相关蛋白的表达变化,进一步探索和验证夏枯草提取物的作用机制。第一部分夏枯草提取物对Karpas299细胞生物学特性的影响方法(1)分别培养Karpas299、Jurkat、HUT78三种T淋巴瘤细胞株。(2)采用CCK8的方法研究夏枯草提取物和长春新碱对Karpas299、Jurkat、HUT78细胞增殖的影响,设置等比浓度梯度。(3)根据CCK8结果,选择Karpas299进行细胞活力测定,倒置显微镜观察细胞形态学。(4)采用EDU检测细胞周期,分析夏枯草提取物组、长春新碱组、夏枯草提取物联合长春新碱组对Karpas299的作用差异。(5)采用流式细胞仪检测细胞凋亡,分析夏枯草提取物组、长春新碱组、夏枯草提取物联合长春新碱组的作用差异。结果(1)夏枯草提取物分别稀释为 100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml的等比浓度,不同浓度的夏枯草提取物分别作用于karpas299、Jurkat、HUT78细胞24、48、72h后,观察对karpas、Jurkat、HUT78细胞均有显著的抑制增殖作用,发现在48h时抗肿瘤细胞增殖作用最强,而且在48h时,对karpas299细胞生长抑制率分别为 79.41±2.56%、61.47.±1.90%、44.52±1.73%、30.38±1.04%、8.23±0.98%。其增殖 IC50 为(33.2±1.8)ug/ml;对 Jurkat 细胞生长抑制率分别为 81.2±2.73%、62.35±1.89%、44.38±1.61%、29.56±1.04%、7.45±0.96%。其增殖IC50为(46.3±2.1)ug/ml;对HUT78细胞生长抑制率分别为78.20±2.49%、60.35± 1.95%、45.38± 1.81%、32.56± 1.04%、9.01 ±0.97%。其增殖 IC50 为(47.1±2.2)ug/ml。且随着夏枯草提取物浓度的增加,其抑制率越来越高,在一定浓度范围内存在剂量依赖性。长春新碱对karpas299细胞也有明显的抑制作用,药物浓度分别为 0.008ug/ml、0.004ug/ml、0.002ug/ml、0.001ug/ml、0.0005ug/ml时,不同浓度的长春新碱分别作用于karpas299、Jurkat、HUT78细胞48h后,对 Karpas299 细胞生长抑制率分别为 86.3±3.59%、67.92±2.66%、54.16±1.72%、27.56±1.38%、9.60±0.83%,其增殖 IC50 为(0.003±0.0004)ug/ml;对 Jurkat 细胞生长抑制率分别为 89.26±2.65、50.19士2.42、41.05±1.87、30.68±1.35、19.73±1.11。其增殖 IC50 为(0.006±0.0009)ug/ml;对 HUT78 细胞生长抑制率分别为 88.47±2.73、50.37±2.35、33.84±1.62、25.66±1.48、18.79±1.59。其增殖IC50为(0.007±0.0008)ug/ml。两种药物对细胞的抑制均有明显的剂量依赖性。(2)从中选择间变性大细胞淋巴瘤Karpas299细胞株作为研究对象,夏枯草提取物及长春新碱注射液处理karpas299细胞的IC50分别为33.2μg/ml、0.003 ug/ml。两种药物各实验组与空白对照组OD值的差异均有统计学意义,P均0.001。(3)夏枯草提取物及长春新碱注射液处理karpas299细胞48h,浓度采用IC50分别为33.2μg/ml、0.003ug/ml。结果显示,空白组G0/G1期细胞占67.1±4.2%,G2/M期细胞占6.2±0.9%,夏枯草提取物组G0/G1期细胞占61.3±3.9%,G2/M期细胞占7.6±1.1%,长春新碱组G0/G1期细胞占43.6±2.0%,G2/M期细胞占26.1±2.5%,联合组G0/G1细胞占51.8±1.4%,G2/M期细胞占10.3±1.4%。经统计学分析提示,与空白组相比,长春新碱组G2/M期细胞明显增多,p0.01(P=0.0016),联合组G2/M期细胞有所增多,p0.05(P=0.038),夏枯草提取物组无明显差异,p0.05。(4)夏枯草提取物及长春新碱注射液处理karpas299细胞48h,浓度采用IC50分别为33.2μg/ml、0.003ug/ml。结果显示,空白对照组的细胞凋亡率(1.32±0.14)%,夏枯草提取物组的细胞凋亡率为(38.9±2.95)%,长春新碱组的karpas299细胞凋亡率为(42.8±3.71)%,联合组的细胞凋亡率为(66.3±7.52)%。统计学显示各给药组均可诱导Karpas299细胞的凋亡,P0.01(P=0.0093,P=0.0064,P=0.0058).小结(1)夏枯草提取物对Karpas299、Jurkat、HUT78细胞有显著的抗增殖作用,其抗增殖作用呈明显的时间、剂量依赖关系。(2)夏枯草提取物对Karpas299的抗增殖作用无明显细胞周期特异性。(3)夏枯草提取物可诱导Karpas299细胞的早期凋亡。第二部分夏枯草提取物作用Karpas299细胞后的蛋白质组学分析及关键蛋白的功能验证方法(1)将Karpas299细胞分3组,分别为空白组、夏枯草提取物作用组(33.2μg/ml)、长春新碱组(0.003ug/ml),每组3个重复,夏枯草提取物、长春新碱作用于Karpas299细胞48h后,分别收集各组细胞,将细胞培养瓶中的细胞用细胞收集液洗涤3次,每管收集细胞个数5.0×107个,液氮冷冻保存。利用1mMPMSF,2mMEDTA及DTT进行蛋白提取。(2)采用BCA法进行蛋白质定量。(3)差异蛋白分子进行生物信息学分析,主要包括GO功能注释和KEGG信号通路富集分析。(4)通过查阅文献,寻找与肿瘤相关的关键差异蛋白,然后对关键蛋白进行Western blot功能验证。结果(1)本项目采用TMT定量蛋白质组学技术开展课题研究,在人细胞中共鉴定到蛋白质6209个。按照表达倍数变化1.2倍以上(上调大于1.2倍或者下调小于0.83倍)且P value0.05的标准筛选差异表达蛋白质。其中,本实验共发现,经质谱成功鉴定表达上调219个蛋白质,表达下调321个蛋白质,与对照组相比,长春新碱组的上调差异表达蛋白质有55个,下调差异表达蛋白质77个。夏枯草提取物组的上调差异表达蛋白质有164个,上调蛋白分别为Protein lifeguard3、AnnexinA1、CD 160 antigen、Perforin 1、Myomegalin、Prothrombin、Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 3B、Extracellular matrix protein 1、Filamin-B、Interferon-induced 35 kDa protein、Smoothelin、Thymidine phosphorylase、Vesicular integral-membrane protein VIP36、CathepsinD、TNF α、Nicotinamide phosphoribosyl transferase等,下调差异表达蛋白质244个,下调蛋白分别为 Collagen type Ⅰ alpha 1、Synaptophysin、UV excision repair protein RAD23 homolog B、Myelin proteolipid protein、Synapsin-1、Antileukoproteinase、E3 ubiquitin-protein ligase RNF123、Stathmin、G02-q chimeric G-protein、Transcription factor c-Jun、Creatine kinase B-type、Putative heat shock protein HSP 90-beta 4、Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type Ⅱ subunit alpha、Protein FAM210A、MSTP067、cDNA FLJ78114、High mobility group protein B2、Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A、CyclinD3 等。经过重组表达质粒转化,蛋白诱导表达、纯化及重组蛋白的富集,SDS-PAGE,从中挑选TNFα、c-Jun和cyclinD3作为明显差异蛋白进行功能验证。(2)Western blot结果显示给药48h后,夏枯草提取物组、长春新碱组、联合组均不同程度下调 p-JAK3、p-STAT3、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、cyclinD3、Bcl-2、mTOR,上调TNFα、Bax、caspase3蛋白表达。与空白对照组相比,夏枯草提取物组高表达 TNFα,P0.05(P=0.0217),低表达 p-cJun,P0.05(P=0.0164),低表达cyclinD3,P0.05(P=0.0329);长春新碱组高表达TNFα蛋白,P0.05(P=0.0283),低表达 p-cJun,P0.05(P=0.0175),低表达 cyclinD3,P0.05(P=0.0272);联合组高表达 TNFα 蛋白,P0.01(P=0.0079),低表达 p-cJun,P0.01(P=0.0052),低表达 cyclinD3,P0.01(P=0.0061)。小结(1)本实验共发现,当夏枯草提取物对karpas299细胞作用48h后,经质谱成功鉴定出具有统计学意义的诸多蛋白质,经查阅相关文献发现这些蛋白多与免疫相关,提示夏枯草提取物抗肿瘤的作用机制可能与此有关。(2)经过Western blot验证,夏枯草提取物下调了 p-JAK3、p-STAT3、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、Bcl-2、cyclinD3、mTOR,上调了 TNFα、Bax、caspase3 蛋白表达,提示可能通过JAK3/STAT3、JNK/cJun、AKT/mTOR信号通路来发挥抗肿瘤的作用。第三部分夏枯草提取物作用Karpas299细胞后的代谢组学分析方法(1)将Karpas299细胞分3组,分别为空白组、夏枯草提取物作用组(33.2μg/ml)、长春新碱组(0.003ug/ml),每组6个重复,夏枯草提取物、长春新碱作用于Karpas299细胞48h后,分别收集各组细胞,将细胞培养瓶中的细胞用细胞收集液洗涤3次,每管收集细胞个数5.0×107个,液氮冷冻保存。(2)采用超声裂解法提取蛋白质。(3)采用 Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱进行分离。分别采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。样品UHPLC分离后用TripleTOF5600质谱仪(ABSCIEX)进行质谱分析。(3)采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。代谢物结构鉴定采用精确质量数匹配(25ppm)和二级谱图匹配的方式。(4)根据目标代谢物在KEGG数据库中的C number分别提取目标代谢物所参与的所有代谢通路,并通过KEGG Mapper软件分别标注代谢通路中的目标代谢物。(5)对代谢物进行聚类分析。在对目标代谢物集合KEGG通路注释的富集分析时,以KEGG通路为单位,以每条通路中所有代谢物为背景,通过Fisher精确检验。结果(1)将QC样本UHPLC-Q-TOFMS总离子流图,进行谱图重叠比较,结果表明各色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠,说明在整个实验过程中仪器误差引起的变异较小。(2)经Pareto-scaling后进行PCA分析,正、负离子模式下QC样本紧密聚集在一起,表明本项目实验的重复性好。(3)夏枯草提取物和空白组在正离子模式下差异代谢物有L-Carnitine、Betaine、L-Palmitoylcarnitine、Taurine、Glycerophosphocholine,负离子模式下差异代谢物有 Stearic acid、Glycerol 3-phosphate、Arachidonic Acid(peroxide free)、Linoleic acid、L-Palmitoylcarnitine、Stearoylcarnitine、Taurine、alpha-D-Galactose 1-phosphate、2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconate。长春新碱组和空白组在正离子模式下差异代谢物有 alpha-D-Glucose 1-phosphate、Uridine 5'-monophosphate(UMP)、Uridine 5'-diphosphate(UDP)、Pantothenate,负离子模式下差异代谢物有 Linoleic acid、L-Citrulline、Uridine 5'-monophosphate(UMP)、alpha-D-Galactose 1-phosphate、cDNA FLJ56762、Alpha-2-HS-glycoprotein、cDNA FLJ52778、Insulin-like growth factorbinding protein 7、Keratin,type Ⅱ cytoskeletal 2 epidermal。小结(1)夏枯草提取物在抑制Karpas299.细胞增殖的过程中,生成了多种代谢物,且有多条代谢通路参与,尤其是UDP-D-Galactose、alpha-D-Glucose 1-phosphate等具有明显差异的代谢产物。(2)这些代谢产物多参与抑制肿瘤细胞的增殖、凋亡,研究这些代谢产物的功能和变化,及对肿瘤细胞增殖的促进或抑制效应。第四部分夏枯草提取物对Karpas299淋巴瘤的体内实验及关键蛋白的功能验证方法(1)使用BALB/c裸鼠构建Karpas299淋巴瘤动物模型,先把夏枯草提取物分为低剂量组、中剂量组、高剂量组,根据抑瘤率筛选出最佳剂量,然后分空白对照组、夏枯草提取物组(最佳剂量组)、长春新碱组、联合组(夏枯草最佳剂量组联合长春新碱组)。(2)每日观察各组荷瘤小鼠的生长情况,隔日称重,记录各组小鼠给药期的体重变化。(3)测量瘤体大小,观察瘤体的变化,最后计算抑瘤率。(4)瘤组织做病理HE染色、免疫组化。(5)根据细胞蛋白质组学的结果,从瘤组织中提取蛋白,通过Westernblot方法来检测 p-JAK3、p-STAT3、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、TNFα、cyclinD3、Bcl-2、Bax、caspase3、mTOR等蛋白在瘤组织中的表达变化。结果(1)Karpas299淋巴瘤动物模型成瘤率100%,结合病理免疫组化染色,证明模型制备成功。(2)夏枯草提取物能够抑制Karpas299淋巴瘤生长。在预实验中,与空白对照组相比,夏枯草中剂量组的瘤重缩小明显,P0.01(P=0.0044),夏枯草低剂量组和高剂量组的瘤重有所缩小,P0.05(P=0.0283,P=0.0196),各组的瘤体积均变化明显,P0.01(P=0.0075,P=0.0062,P=0.0071)。各组抑瘤率分别为27.3%、40.1%、31.5%。因此我们选择夏枯草中剂量组作为正式实验的剂量。在正式实验中,与空白对照组相比,夏枯草提取物组、长春新碱组和联合组瘤组织体积增大明显减少,P0.01(P=0.0094,P=0.0091,P=0.0077),夏枯草提取物组、长春新碱组和联合组的平均瘤重明显小于空白对照组,P0.01(P=0.0072,P=0.0055,P=0.0068)。各组抑瘤率分别为 38.9%、39.5%、39.1%。(3)免疫组化提示T细胞标记CD3,CD5,CD7均呈现不同程度的表达,CD30均为弥漫细胞膜阳性。ALK在空白对照组和夏枯草提取物组为细胞浆阳性,其余组均为阴性。ki-67在空白对照组,夏枯草提取物组和长春新碱组增殖指数较高,为60-80%.在其他组增殖指数为30-40%。与空白对照组相比,各给药组表达c-Jun均有所降低,P0.05(P=0.0291)。各给药组之间比较无明显差异,P0.05。各给药组cyclinD3的表达均有所降低,P0.05(P=0.0406)。联合组的cyclinD3明显降低,P0.01(P=0.0054)。各给药组均高表达TNFα,夏枯草提取物组TNFα表达有所增加,P0.05(P=0.0316),长春新碱组和联合组TNFα的表达明显增加,P0.01(P=0.0082)。(4)通过Western blot检测各组瘤组织的蛋白表达,与空白对照组相比,夏枯草提取物组高表达TNFα,P0.01(P=0.0047),低表达p-cJun,P0.05(P=0.0265),低表达 cyclinD3,P0.05(P=0.0329);长春新碱组高表达 TNFα蛋白,P0.01(P=0.0051),低表达 p-cJun,P0.01(P=0.0078),低表达 cyclinD3 P0.01(P=0.0096);联合组高表达 TNFα 蛋白,P0.01(P=0.0015),低表达 p-cJun,P0.01(P=0.0012),低表达 cyclinD3,P0.01(P=0.0053)。小结(1)体内实验表明夏枯草提取物能够抑制Karpas299淋巴瘤,且夏枯草中剂量组疗效优于高剂量组和低剂量组。(2)通过免疫组化和Western blot验证,夏枯草提取物下调了 p-JAK3、p-STAT3、p-JNK、p-c-Jun、p-AKT、Bcl-2、cyclinD3、mTOR,上调了 TNFα、Bax、caspase3蛋白。夏枯草提取物可能是通过JAK3/STAT3、JNK/cJun、AKT/mTOR信号通路来发挥抗肿瘤作用。全文结论1.夏枯草提取物对Karpas299细胞有显著的抗增殖、促凋亡作用,无明显细胞周期特异性。2.夏枯草提取物作用Karpas299细胞后,经质谱成功鉴定表达上调219个蛋白质,表达下调321个蛋白质,这些蛋白可能揭示夏枯草提取物抗肿瘤的作用,经Western blot验证,夏枯草提取物可能通过JAK3/STAT3、JNK/cJun、AKT/mTOR信号通路来发挥抗肿瘤作用。3.夏枯草提取物作用Karpas299细胞后,经代谢组学分析,正离子模式有9种差异代谢物,负离子模式有14种差异代谢物,这些代谢物大多在肿瘤细胞的代谢过程中发挥了重要作用,可能是夏枯草提取物抑制Karpas299细胞的作用机制。4.夏枯草提取物能够抑制Karpas299淋巴瘤生长,可能通过JAK3/STAT3、JNK/cJun、AKT/mTOR信号通路来发挥抗肿瘤作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：
具有明显的周期特异性，夏枯草提取物组未显示明显的细胞周期特异性，联合逡逑组也将细胞周期阻滞于ｍ期，具有细胞周期特异性，但由于细胞大量凋ｒ：，较逡逑长春新碱组有所下降。（见图１．３）逡逑１３逡逑
各组karpas299G2/M期细胞的检测
枯草提取物对Ｋａｒｐａｓ邋２９９细胞增殖的影响逡逑研[偨峁允鞠目莶萏崛∥锒裕耄幔颍穑幔箦澹玻梗瓜赴邢灾脑鱿目莶萏崛∥锱ǘ鹊牟煌湟种坡仕孀排ǘ鹊脑黾雍褪弊哦矣忻飨缘募亮亢褪奔湟览敌浴Ｍ恢忠┪锒圆煌牡模崾疽┪锒圆煌闹琢鱿赴乖鲋匙饔檬遣煌Ｏ赴卣鳎赴苑至训姆绞浇性鲋场Ｖ琢鱿赴纳恚皇苷Ｉさ骺叵低车目刂疲艹中姆至延朐鲋常郏福梗荨Ｒ部怪琢龅闹匾饔弥弧Ｏ目莶荻灾琢鱿赴囊种圃鲋场３鲁びⅲ郏梗眩莘⑾窒目莶萏崛∥锬芄灰种疲遥幔辏橄赴鲋常确段冢孀畔目莶萏崛∥锱ǘ鹊脑黾樱涠裕遥幔辏橄赴镎癫郏梗保莶捎茫停裕苑ü鄄煜目莶萏崛∥镒饔茫剩酰颍耄幔粝赴筇崛∥锟上灾种疲剩酰颍耄幔粝赴纳ぃ⒂幸欢ǖ牧啃Ч叵担
本文编号：2782430
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：
具有明显的周期特异性，夏枯草提取物组未显示明显的细胞周期特异性，联合逡逑组也将细胞周期阻滞于ｍ期，具有细胞周期特异性，但由于细胞大量凋ｒ：，较逡逑长春新碱组有所下降。（见图１．３）逡逑１３逡逑
各组karpas299G2/M期细胞的检测
枯草提取物对Ｋａｒｐａｓ邋２９９细胞增殖的影响逡逑研[偨峁允鞠目莶萏崛∥锒裕耄幔颍穑幔箦澹玻梗瓜赴邢灾脑鱿目莶萏崛∥锱ǘ鹊牟煌湟种坡仕孀排ǘ鹊脑黾雍褪弊哦矣忻飨缘募亮亢褪奔湟览敌浴Ｍ恢忠┪锒圆煌牡模崾疽┪锒圆煌闹琢鱿赴乖鲋匙饔檬遣煌Ｏ赴卣鳎赴苑至训姆绞浇性鲋场Ｖ琢鱿赴纳恚皇苷Ｉさ骺叵低车目刂疲艹中姆至延朐鲋常郏福梗荨Ｒ部怪琢龅闹匾饔弥弧Ｏ目莶荻灾琢鱿赴囊种圃鲋场３鲁びⅲ郏梗眩莘⑾窒目莶萏崛∥锬芄灰种疲遥幔辏橄赴鲋常确段冢孀畔目莶萏崛∥锱ǘ鹊脑黾樱涠裕遥幔辏橄赴镎癫郏梗保莶捎茫停裕苑ü鄄煜目莶萏崛∥镒饔茫剩酰颍耄幔粝赴筇崛∥锟上灾种疲剩酰颍耄幔粝赴纳ぃ⒂幸欢ǖ牧啃Ч叵担
本文编号：2782430
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