葛黄颗粒含药血清对乙醇诱导L-02细胞损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-08-07 05:55

【摘要】：目的:本研究通过体外细胞实验观察葛黄颗粒含药血清对乙醇诱导的L-02细胞的影响,以探讨其对ALD的保护作用和分子机制。方法:1、含药血清的制备:雄性Sparague-Dawley大鼠(简称SD大鼠)60只,体重180-220g,随机分为3组,每组20只,分别为空白对照组、葛黄颗粒组(3.1g生药/100g体重/天),美他多辛组(0.1g/100g/天),每日给药2次,早晚各一次,连续给药5天。禁食12h在末次给药前,但不限制饮水,于最后一次给药后1h,麻醉动物,腹主动脉取血制备含药血清。2、造模及干预:CCK8法筛选出最佳乙醇浓度范围。同时用全自动生化分析仪检测细胞上清液AST、LDH,结合CCK8结果,以确定造模时间及造模的乙醇浓度。细胞实验分为正常组、模型组、葛黄颗粒高剂量组(高剂量组)、葛黄颗粒中剂量组(中剂量组)、葛黄颗粒低剂量组(低剂量组)、美他多辛组(阳性对照组),细胞接种24h后,正常组加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,模型组在上述基础上加入乙醇,另外各组加入乙醇及不同剂量的含药血清,干预24h后,收集细胞上清液及细胞进行后续的检测。3、检测:细胞上清液AST、LDH用全自动生化分析仪检测,细胞凋亡用流式细胞仪检测,检测Fas、FasL、Caspase3、Caspase8 mRNA的表达用RT-PCR法,Fas、FasL蛋白的表达情况用免疫组化法观察。结果:1、模型建立:运用3%的乙醇干预L-O2肝细胞24h,AST、LDH含量升高,肝细胞体积稍增大,悬浮的细胞较前稍增多,成功建立酒精性肝损伤l-02细胞模型。2、在模型组,l-o2细胞的凋亡率显著增高(p0.05),经含药血清干预后,凋亡率在中剂量组、高剂量组和阳性对照组中的表达明显降低(p0.05),中剂量组与阳性对照组之间差异显著(p0.05),高剂量组和阳性对照组之间无显著性差异(p0.05)。3、在模型组中,l-02细胞上清液的ast、ldh的含量及fas、fasl、caspase3、caspase8的基因表达显著升高(p0.05),经含药血清干预后,这些指标在中剂量组、高剂量组和阳性对照组中的表达明显降低(p0.05),中剂量组与阳性对照组之间差异显著(p0.05),高剂量组和对照组之间无显著性差异(p0.05)。4、fas、fasl蛋白阳性的表达可以在各组肝细胞的细胞膜上见到,其中棕黄色染色较浅的是正常组,而模型组染色最深,高、中、低剂量组染色均较模型组变浅,其表达呈现出剂量依赖性降低。阳性对照组染色也较模型组变浅。结论:1、3%的乙醇处理l-o2肝细胞24h后可以成功诱导肝细胞受损,显微镜下观察肝细胞体积稍增大,悬浮的细胞较前稍增多,表明酒精性肝损伤细胞模型复制成功。2、葛黄颗粒含药血清可以降低细胞上清液中ast、ldh的含量,改善肝功受损情况,表明其对酒精性肝损伤有较好的保护作用。3、葛黄颗粒含药血清可下调fas、fasl、caspase3、caspase8mrna的表达,减少fas、fasl蛋白的表达,减少凋亡率,提示其对酒精性肝损伤的保护作用可能与抑制细胞凋亡有关。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

细胞活力,乙醇,肝细胞,作用时间

图 1 不同浓度乙醇作用于人 L-02 肝细胞 6h、12h、24h 细胞活力的比较.2 乙醇作用时间的确定实验结果显示（表 6，图 2），用不同浓度的乙醇作用于 L-02 细胞，分于 6h，12h，24h 收集细胞上清液测定 AST、LDH，随着乙醇浓度的增加，ST、LDH 含量增加。仅当乙醇浓度为 2.5%、3%、5%时，作用时间为 24h AST、LDH 含量与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结合细胞力及显微镜下细胞形态观察，最终选取 24h 作为乙醇诱导肝细胞损伤的适时间。 6 不同浓度乙醇作用于人 L-02 肝细胞 6h、12h、24h 后 AST、LDH 含量( x±s，n=4)6h 12h 24hAST(U/L) LDH(U/L) AST(U/L) LDH(U/L) AST(U/L) LDH(U/L)

肝细胞,乙醇,肝细胞损伤,培养细胞

图 2 不同浓度乙醇作用于人 L-02 肝细胞 6h、12h、24 后 AST、LDH 含量的比较2 乙醇诱导肝细胞损伤模型的构建显微镜下观察可见，模型组通过含 3%乙醇的培养基培养细胞 24h 后，其肝细胞体积稍增大，悬浮的细胞较正常组稍增多（图 3）。

模型图,肝细胞损伤,模型,培养细胞

【相似文献】