甘草miRNA-156通过肠道菌影响小鼠免疫

发布时间：2020-08-08 08:17

【摘要】：背景和目的:本实验室前期研究已发现,甘草中含有丰富的小分子miRNA,高通量测序发现,miRNA156在甘草中的丰富度位居前位。后经体外共培养实验表明,甘草miRNA对人体免疫细胞的基因表达有一定的调节作用;体内实验表明,甘草miRNA对肠道菌和肠道免疫系统也具有一定的调节作用。本研究主要是研究甘草miRNA156是如何调节小鼠的免疫系统,而肠道菌又在其中扮演了怎样的角色。方法:1.体外实验:NCBI检测甘草miRNA156 mimic序列靶点细菌,培养后分别和miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor共培养,通过检测OD600观察生长曲线的变化。2.体内实验:将BALB/C小鼠随机分为6组,组内分为灌胃组和同笼组,其中6组分别灌胃甘草水提物(1.5g/kg)、甘草酸(0.375g/kg)、miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor,另外6组分别与上述6组同笼喂养,喂养7天后收集粪便进行16SV3-V4区测序,分析各组肠道微生物的改变。3.取小鼠回肠组织和结肠组织,一部分回肠液氮脱水,加Trizol研磨提取RNA后用于转录组测序,分析差异基因,一部分回肠和结肠在4%多聚甲醛固定后,切片石蜡包埋,HE染色,显微镜下拍照分析各组肠道切片之间的差异。4.取小鼠脾脏,提取RNA后RT-QPCR验证差异基因在脾脏中的表达情况。结果:1.检测到miRNA156靶向鲍曼不动杆菌,大肠杆菌作为对照,将鲍曼不动杆菌与大肠杆菌分别测定自由生长条件下的生长曲线,并测定鲍曼不动杆菌与大肠杆菌分别与miRNA156 mimic、miRNA156mutant、miRNA156 inhibitor共培养至平台期的生长曲线,由生长曲线可见miRNA156 mimic对鲍曼不动杆菌的生长有调节作用,大肠杆菌共培养则没有发现差异。2.粪便16S测序结果表明,甘草水提物组、甘草酸组、miRNA156mimic组的灌胃组与同笼组肠道菌群趋于一致,在miRNA156 mimic组的灌胃组与同笼组中发现,乳酸菌群含量大幅度增多,而miRNA156mutant、miRNA156 inhibitor灌胃组和同笼组中乳酸菌含量显著性降低。3.回肠转录组测序结果表明,甘草水提物灌胃组、甘草酸灌胃组和miRNA156 mimic灌胃组免疫相关信号通路富集,而miRNA156mutant灌胃组和miRNA156 inhibitor灌胃组并没有大量的免疫相关信号通路出现差异,甘草水提物灌胃组与同笼组肠道通路富集情况明显不同,而miRNA156 mimic灌胃组和同笼组肠道结果趋于一致,都是免疫相关通路富集;比较回肠和结肠的HE染色结果发现,miRNA156mimic组肠道结构较完整,甘草水提物组和甘草酸组有局部轻微水肿,而miRNA156 mutant组和miRNA156 inhibitor组出现少量肠腺坏死和局部水肿,各组同笼组与灌胃组病理情况趋于一致,miRNA156 mimic灌胃组和同笼组肠道状态明显呈现良好状态。甘草水提物灌胃组和miRNA156 mimic灌胃组肠道状态趋近,而甘草水提物同笼组与灌胃组差异较明显,miRNA156 mimic灌胃组与同笼组肠道状态也趋于一致,说明甘草miRNA156是甘草水提物的有效成分,并且miRNA156可以通过肠道菌影响小鼠肠道免疫。4.脾脏验证结果表明,灌胃甘草miRNA156不仅会影响小鼠肠道免疫,也会对脾脏免疫系统造成一定的影响,说明灌胃甘草miRNA156对免疫系统产生的影响是全身性的,不是局限性的。结论:通过粪便16S测序结果发现,灌胃组和同笼组在共培养的条件下,肠道菌趋于一致,且miRNA156 mimic组肠道有益菌明显增多;通过肠道转录组结果和肠道病理切片结果说明甘草水提物中有效成分不仅有甘草酸,也有miRNA156,甘草miRNA156通过对肠道菌的调节,改善小鼠肠道免疫,甚至影响小鼠脾脏免疫基因表达水平。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

图 1-1 NCBI 网站比对序列结果Fig.1-1 The results of alignment sequence in NCBI website1.4.2 大肠杆菌和鲍曼不动杆菌生长曲线通过测定 OD600，绘制大肠杆菌和鲍曼不动杆菌的生长曲线，如图 1-2 所示。

图 1-2 大肠杆菌和鲍曼不动杆菌生长曲线（a.大肠杆菌；b.鲍曼不动杆菌）Fig 1-2 Growth curves of Escherichia coli and Acinetobacter baumannii (a. Escherichia coli; b.Acinetobacter baumannii)1.4.3 大肠杆菌和鲍曼不动杆菌共培养生长曲线图 1-3 大肠杆菌和鲍曼不动杆菌共培养生长曲线（a.大肠杆菌；b.鲍曼不动杆菌,*p＜0.05）

13图 1-3 大肠杆菌和鲍曼不动杆菌共培养生长曲线（a.大肠杆菌；b.鲍曼不动杆菌,*p＜0.05）Fig 1-3 Co-culture growth curve of E. coli and Acinetobacter baumannii (a. E. coli; b.Acinetobacter baumannii，*p＜0.05)分别测定大肠杆菌和鲍曼不动杆菌与 miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor 共培养后的 OD600 值，绘制得生长曲线，发现大肠杆菌与miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor 三者共培养后细菌生长没有发生变化；而鲍曼不动杆菌与 miRNA156 mimic、miRNA156 mutant、miRNA156 inhibitor 三者共培养后，鲍曼不动杆菌和 miRNA156 mimic 组 OD600

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本文编号：2785303