黄伞菌次级代谢物抗肿瘤活性物质的分离鉴定

发布时间：2020-08-08 16:40

【摘要】：作为天然药物资源的重要组成部分,食药用真菌发挥着重要的作用。现已从食药用真菌的子实体内分离出多种具有生理活性的物质,如:多糖、多肽、蛋白质、萜类、固醇类、凝集素等,经实验验证具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血糖、降血压以及免疫调节等生物学功能。黄伞菌作为一种药食性真菌,是目前最具开发潜力的食药用真菌,具有丰富的食用价值和药用价值。随着研究的深入,已有部分研究发现黄伞菌次级代谢产物能够提高机体的免疫系统,以及对某些肿瘤细胞能够起到一定的抑制作用,为黄伞菌的进一步研究提供了有利的证据。本文旨在提取黄伞菌次级代谢物中的抗肿瘤活性物质,对其进行分离鉴定,为天然代谢产物的研究与开发提供新的思路。通过乙酸乙酯萃取的方法提取液氮研磨的新鲜黄伞菌子实体粉末中的次级代谢物,经过反复的过滤、旋蒸、甲醇溶解、干燥等一系列方法,最终得到浸膏状的黄伞菌次级代谢产物。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定抗肿瘤活性,采用体外抗肿瘤活性跟踪与化学分离相结合的方法来分离黄伞菌次级代谢产物。利用高效液相色谱(HPLC)分离次级代谢产物中的抗肿瘤活性成分,根据理化性质和图谱数据鉴定化学结构,主要利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)和核磁共振(NMR)对收集得到的抗肿瘤活性成分进行鉴定。具体研究结果如下:1.乙酸乙酯摇床提取最终得到黄伞菌次级代谢物浸膏。液氮研磨的新鲜黄伞菌子实体粉末加入1.5~2倍的乙酸乙酯摇床提取72 h,旋转蒸发仪蒸干共得到黄伞菌次级代谢产物浸膏净重为7.59 g。2.C18半制备色谱柱和C18分析色谱柱分离黄伞菌次级代谢物分别得到5个峰谱和3个活性峰谱。高效液相色谱分离甲醇充分溶解后的黄伞菌次级代谢物浸膏,首先C18半制备色谱柱按照甲醇:超纯水=20%:80%的比例分离得到5个峰谱,所处的时间段分别为2~4 min、4~4.5 min、4.5~7 min、7~10 min以及10~14 min;其次C18分析色谱柱根据MTT法的结果对半制备色谱柱中的2个活性较高的峰谱再次分离,共得到3个活性峰谱,第一个峰谱所处的时间段分别为6.8~9.8 min,第二个峰谱为4.2~8 min,第三个峰谱为18~20.5 min。3.MTT比色法体外测定黄伞菌次级代谢物的抗肿瘤活性,最终确定HPLC两次分离得到的所有峰谱中共有5个具有较高的抗肿瘤活性。MTT被活细胞线粒体内的脱氢酶还原成结晶状的深紫色的产物formazan,该产物能够被特定溶剂完全溶解,然后用酶标仪测定其在570 nm波长附近的吸光度(OD值)。HPLC两次分离得到的峰进行MTT实验,检测到其中5个具有较高的抗肿瘤活性。4.HPLC分离得到的纯品进行鉴定,得到3号峰中活性物质可能的相对分子质量及结构式。利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)、液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)和核磁共振(NMR)对HPLC分离得到的具有抗肿瘤活性的纯品进行鉴定,得出其分子式和化学结构等特征,经过上述方法初步确定3号峰中的活性物质的相对分子质量和结构式。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.2
【图文】：

打浆机,子实体

黄伞Figure2-1Pholiotaadiposa

次级代谢产物,菌子,粉末,甲醇

图 2-2 黄伞次级代谢产物Figure 2-2 The secondary metabolite of P. adipos分离黄伞菌子实体粉末经乙酸乙酯萃取，甲醇

流动相,甲醇,图谱,超纯水

图 2-3 20%甲醇流动相 HPLC 分离图谱Figure 2-3 20% methanol flow phase HPLC separation map（2）图 2-4 为 5%甲醇流动相 HPLC 分离图谱，该图谱分离的是图 2-3 中大量收集干燥后的第 3 个峰(4.5-7 min)，流动相比例为甲醇:超纯水=5%:95%（为了保证峰型更加清晰，超纯水中加入了 0.1%/L 的三氟乙酸）。每针进样体积为 50 μ

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