锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤作用及其机制研究

发布时间：2020-08-09 00:46

【摘要】：目的:通过建立大鼠Langendroff离体心肌缺血再灌注损伤动物模型以及在体心肌缺血再灌注损伤动物模型,进行锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤的药效学研究,并在明确锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤作用的基础上,采用网络药理学方法对其作用机制进行预测,并运用Western blotting方法对其作用机制进行实验研究。方法:1.锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤药效学研究SD大鼠72只,随机分为正常组、模型组、阳性药组(盐酸维拉帕米注射液,给药剂量为5×10~(-7)mol/L)、锦鹤养心方总黄酮高、中、低剂量组(给药剂量分别为16、8、4mg/L)6组,每组12只。实验前各组大鼠适应性饲养一周,制备离体大鼠心脏,采用langendorff离体心脏灌流,连接ML870型8通道生理信号记录分析系统,通过对大鼠离体心脏进行平衡20min,停灌30min,复灌60min处理,建立离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,复灌时除正常组和模型组外其他各给药组分别以三个不同浓度的锦鹤养心方总黄酮、盐酸维拉帕米注射液进行灌注,观察平衡期、复灌末期各组大鼠HR(心率)、+dp/dt _(max)(左心室内压最大上升速率)、-dp/dt _(max)(左心室内压最大下降速率)血流动力学指标的变化;复灌结束后,从灌注装置上取下心脏,切取左心室固定于4%多聚甲醛组织固定液中,用HE染色法观察大鼠心肌组织病理形态学变化。SD大鼠72只,随机分为假手术组、模型组、阳性药组(复方丹参滴丸,给药剂量为0.081g·kg~(-1))、锦鹤养心方总黄酮高、中、低剂量组(给药剂量分别为2,1,0.5g·kg~(-1))6组,每组12只。各组大鼠实验前适应性喂养一周,连续灌胃给药14 d,给药体积均为2 mL/100g,每天给药1次,末次给药2小时后造模。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支,建立大鼠在体心肌缺血再灌注损伤模型,I/R时段为30min/2h。实验结束后腹主动脉取血,静置30 min后离心(4°C,3000 r·min~(-1),15 min),取上清放入-80°C冰箱冻存,用于测定血清学指标乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量及活性;取血后留取心脏,用TTC染色法进行心肌梗死面积的测定;剪取结扎线以下的左心室部分组织,用HE染色法进行心肌组织病理形态学的测定。取左心室部分组织,置于-80°C冰箱冻存。2.基于网络药理学的锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤作用机制研究查阅相关文献,收集锦鹤养心方组方药材地锦草、仙鹤草、分心木黄酮类化学成分,并以“类药五原则”筛选潜在的活性成分,采用PharmMapper服务器反向药效团匹配方法预测活性成分潜在作用靶点,并根据OMIM等数据库中与心肌缺血再灌注相关的靶点,筛选锦鹤养心方黄酮类成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用靶标,通过对靶标进行GO功能富集分析和KEGG通路分析,并构建活性成分、抗心肌缺血再灌注损伤作用靶点及通路之间的网络图,探讨锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制。运用Western blotting方法检测左心室组织中TLR-4、MyD88、p-NF-κB、NF-κB、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK蛋白的表达水平,对TLR4-NF-κB信号通路进行验证。结果:1.锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤药效学研究离体心肌缺血再灌注损伤实验中,血流动力学结果显示,锦鹤养心方总黄酮高、中、低剂量组均可提高大鼠离体心肌缺血再灌注末期的HR、+dp/dt _(max)、-dp/dt _(max)水平;HE染色结果显示锦鹤养心方总黄酮各剂量组可以明显改善心肌缺血再灌注造成的心肌病理损伤。在体心肌缺血再灌注损伤实验中,血清学指标检测结果显示锦鹤养心方总黄酮不同剂量组均可显著改善在体大鼠缺血再灌注所致的心肌功能损伤,减少LDH、CK-MB、MDA、IL-6、TNF-α的水平,增加SOD的活性;TTC染色结果显示锦鹤养心方总黄酮各剂量组可以明显减小大鼠的心肌梗死面积;HE染色结果显示锦鹤养心方总黄酮各剂量组可以使心肌细胞病理损伤得到明显改善。2.基于网络药理学的锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤作用机制研究网络药理学分析共获得锦鹤养心方潜在的黄酮类活性成分9个,预测成分作用靶标共95个,筛选出与抗心肌缺血再灌注损伤相关的关键靶点48个,KEGG通路富集分析发现锦鹤养心方总黄酮抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制可能与Toll-like receptor signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway等信号通路有关。Western blotting结果显示锦鹤养心方总黄酮可使心肌缺血再灌注损伤组织中TLR-4、MyD88、p-NF-κB、p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白的表达水平降低。结论:锦鹤养心方总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,且该作用与其调节TLR4-NF-κB信号通路有关。
【学位授予单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R-332

【参考文献】