树舌子实体多糖分离纯化、结构表征及抗肿瘤活性研究

发布时间：2020-08-10 20:27

【摘要】：树舌[Ganoderma lipsiense(Batch)G.F.Atk,.Syn.G.applanatum(pers.)Pat.;Elfvingia applanate(Pers.)Karst.]又名“平盖芝”、“扁灵芝”,属灵芝科灵芝属真菌,其全国分布广泛;其性平,味微苦,在中医中已有几千年的药用历史。树舌子实体多糖是树舌的重要活性成分,具有抗肿瘤、抗氧化、调节机体免疫等多种生物活性,但在其抗肿瘤机制方面的深入研究不多,本论文主要通过四部分试验研究以期阐明树舌子实体多糖的抗肿瘤机制及抗肿瘤过程中的细胞信号转导途径。一:树舌子实体多糖的分离纯化及结构表征响应面法和单因素试验对树舌子实体粗多糖的热水浸提工艺条件进行优化;所得树舌子实体粗多糖通过DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephacyral S-300 HR凝胶柱层析继续纯化,得到多糖GAP-3S,高效凝胶渗透色谱(HPGPC)分析GAP-3S的分子量,高效液相(HPLC)分析GAP-3S的单糖组成,并对GAP-3S进行红外光谱分析。结果:单因素试验和响应面优化树舌子实体粗多糖的热水浸提工艺条件:液料比43(mL/g)、提取时间4.5 h、提取温度100℃,在此工艺参数下树舌子实体多糖的提取率为5.03%;纯化后所得树舌子实体多糖GAP-3S的分子量为6.82?10~5 Da,主要由葡萄糖(60.1%)、半乳糖(22.1%)、岩藻糖(9.3%)和木糖(8.5%)组成;红外光谱分析显示,GAP-3S含有β-呋喃糖等结构。二:GAP-3S对MCF-7细胞的作用不同浓度GAP-3S(0,125,250,500μg/mL)处理MCF-7细胞后,通过MTT法测定MCF-7细胞的增殖率;PI单染、Hoechst 33258、Annexin V-FITC/PI双染等确定GAP-3S对MCF-7细胞凋亡及细胞周期阻滞的影响;荧光定量PCR测定凋亡相关基因mRNA表达水平;Western Blotting测定MCF-7细胞凋亡相关蛋白表达水平;试剂盒检测Caspase-3、-8、-9蛋白活性。结果:GAP-3S能够以剂量及时间依赖的方式抑制MCF-7细胞的增殖;Hoechst 33258染色法、结晶紫染色法观察细胞形态及细胞划痕法观察细胞迁移率等一系列形态学研究结果表明,GAP-3S能够诱导MCF-7细胞出现染色质固缩、边缘羽化及迁移能力下降,同时能使MCF-7细胞细胞周期发生G0/G1期周期阻滞、增加MCF-7细胞凋亡细胞比例;荧光定量PCP和Western Blotting结果表明GAP-3S能够显著上调凋亡相关蛋白P53、P21、Cleaved-Caspase-3、Caspase-9和Cleved-PARP蛋白表达量,从基因和蛋白水平确定GAP-3S能够诱导MCF-7细胞凋亡;GAP-3S同样能够增加Caspase-3、Caspase-9蛋白活性,与上述蛋白表达测定结果一致,但Caspase-8活性无明显变化,表明线粒体凋亡途径可能在GAP-3S诱导MCF-7细胞凋亡过程中发挥重要作用。三:GAP-3S诱导MCF-7细胞凋亡的线粒体机制试剂盒测定不同浓度GAP-3S(0,125,250,500μg/mL)处理MCF-7细胞后,MCF-7细胞的ROS含量、Ca~(2+)浓度、线粒体跨膜电位、抗氧化酶活性的变化;Western Blotting分析GAP-3S对MCF-7细胞Bax、Bcl-2、胞浆和线粒体中Cyt-C蛋白表达水平的影响;实时荧光定量PCR测定Bax和Bcl-2 mRNA表达水平。结果:GAP-3S能够破坏MCF-7细胞线粒体膜电位,增加MCF-7细胞内钙离子浓度及ROS含量;增加抗氧化酶SOD、GPx活性,抗氧化剂GSH含量上升;GAP-3S能够显著增加促凋亡蛋白Bax的mRNA和蛋白表达量,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白表达量,同时GAP-3S能够影响MCF-7细胞中Cyt-C亚细胞定位,促进Cyt-C由线粒体向胞浆中的释放;以上结果提示,线粒体凋亡途径在GAP-3S诱导MCF-7细胞凋亡过程中扮演重要作用。四:GAP-3S对MCF-7细胞MAPK及NF-κB信号通路的影响试剂盒检测GAP-3S处理MCF-7细胞后NF-κB核移位情况;Western Blotting检测IκB、P38、JNK、ERK及p-IκB、p-P38、p-JNK、p-ERK的蛋白表达水平。结果:GAP-3S能够增加MAPKs家族与炎症和凋亡相关成员P38、JNK的磷酸化水平,降低与增殖分化相关成员ERK的磷酸化水平,表明MAPKs在GAP-3S刺激MCFP-7细胞后胞内信号转导中发挥作用;GAP-3S能够增加IκB蛋白的磷酸化水平,促进p65蛋白的核移位,从而激活NF-κB信号通路,表明NF-κB信号通路同样参与了GAP-3S刺激MCF-7细胞胞内信号转导过程。综上所述,树舌子实体多糖GAP-3S作用MCF-7细胞后,能够刺激MCF-7细胞产生相应反应,MCF-7细胞内MAPKs家族被活化,将GAP-3S的胞外刺激级联放大传递至胞内,NF-κB接收到上游MAPKs信号后继续将刺激信号传递至核内,从而启动刺激相关基因的转录翻译,活化线粒体途径,启动细胞程序性死亡,最终执行细胞凋亡。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285
【图文】：

增加巨噬细胞吞噬活性，延缓肿瘤生长[61]。从可食用平菇子实体中提取的多列腺癌细胞凋亡，并抑制人乳腺癌和结肠癌细胞增殖[62]。毛木耳多糖[63]对几胞系同样具有很好的增殖抑制作用。对于上述绝大多数真菌葡聚糖多糖的免疫调节及抗肿瘤活性可能是涉及特异细胞、T 细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞相互作用的结果，从而白增加、吞噬作用的增加及细胞因子的分泌（如白细胞介素、肿瘤坏死因子到免疫调节和抗肿瘤作用。A

定8]测定 GAP 总糖含量制：一定量的葡萄糖置于 105℃烘箱中干燥至恒重以置成 100 μg/mL 葡萄糖标准液。准确量取 0、0.2、0中，加蒸馏水补至 2 ml，每只试管中加入 1.0 mL 6%温冷却，分光光度计（λ490）测定。以葡萄糖含量准曲线。如图 2.1，标准曲线回归方程：y=0.0074x 测定：配置一定浓度 GAP 样品溶液，取 0.5mL 按上品中总糖含量。

图 2.2 还原糖标准曲线Fig. 2.2 The standard curve of determination of reducing suga测定苯法[129]测定 GAP 中糖醛酸含量：溶液 1（1.50 mg/mL 间羟基联苯溶液）：15 mg 间羟 2（0.0125 mol/L 四硼酸钠-浓硫酸溶液）：0.476 g 四60 μg/mL 半乳糖醛酸标准溶液）：15 mg 半乳糖醛酸制：准确移取标准糖醛酸溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4，冰水浴中向各管加入 3 mL 溶液 2，漩涡震荡，沸。再向各管中加入 50 μL 溶液 1，混匀后，520 nm 处( μg )为横坐标，OD 值为纵坐标，得标准曲线。如x + 0.0135，R2=0.9946。制一定浓度 GAP 溶液，一般稀释 2~3 个浓度，取 G OD 值，带入回归方程，得样品中半乳糖醛酸含量。

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本文编号：2788570