太子参抗T2DM活性部位均一多糖的分离、结构表征及其吸收特征研究

发布时间：2020-08-10 21:17

【摘要】：太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根,是中医临床常用补虚药,生津润肺、益气健脾是太子参的主要功效,用于治疗脾虚体倦、气阴不足、病后虚弱、食欲不振、自汗口渴、肺燥干咳等症状。糖尿病在中医中被称为消渴症,气阴双补、益气健脾是中医治疗消渴症的重要途径,因此,太子参在中医治疗糖尿病的处方中被广泛应用。本课题组前期,利用水提醇沉法对太子多糖进行分级醇沉,得到不同级别的太子参多糖,以1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)动物模型为基础,对不同级别的太子参多糖进行降糖考察,发现各级别太子参多糖对1型糖尿病动物模型只有微弱的降糖作用,而对2型糖尿病动物模型的降糖效果明显,其中分子量为50kDa～200kDa范围的太子参多糖(PF40)降糖效果尤为显著。太子参PF40多糖能够改善2型糖尿病动物模型的胰岛素耐量和糖耐量,改善胰岛素抵抗。太子参多糖具有降糖作用,但对太子参多糖降糖作用的研究仅停留在太子参粗多糖层面上,对其分离提纯,结构表征没有深入的研究,而不同纯度的太子参多糖、不同分子量的太子参多糖和不同结构的太子参多糖其降糖活性也可能具有差异。因此,本实验利用水提醇沉法、DEAE-纤维素和不同排阻范围的葡聚糖凝胶柱联用的方法对太子参多糖进行分离提纯,得到太子参均一多糖,并对其结构进行解析,使太子参多糖抗糖尿病研究突破了粗多糖层面,达到了均一多糖的水平。本课题利用不同浓度的乙醇对太子参多糖分级沉淀得到太子参PF40多糖,分离得到的太子参PF40多糖进一步的分离纯化得到太子参均一多糖。并利用柱前衍生化法测定太子参均一多糖的单糖组成,利用比旋光仪、UV、IR、NMR等多种波谱分析技术对太子参均一多糖的结构进行分析,对太子参均一多糖的空间结构做了进一步的研究。Caco-2细胞是一种人克隆的结肠腺癌细胞(human colon carcinoma cell line),其生理结构、功能和生化作用类似于人的小肠上皮细胞,Caco-2细胞模型是近年来国内外研究药物小肠吸收的体外模型。太子参均一多糖自身不含发色团,本课题利用异硫氰酸荧光素(FITC)对太子参均一多糖进行荧光标记,使其具有荧光基团便于检测与追踪。并且利用Caco-2细胞模型模拟人小肠上皮细胞对太子参均一多糖的吸收,探索太子参多糖的吸收途径。本实验通过对太子参多糖的分离纯化得到均一多糖,利用现代波谱技术对其结构进行分析,使太子参均一多糖的构效关系更为明确,并且利用体外模型模拟小肠吸收,研究太子参均一多糖的吸收途径,为太子参降糖药的研发奠定基础。
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284
【图文】：

逑到Ｃ１－，样品再次减压浓缩至１０ｍＬ后，冷冻干燥，既得样品命名为０．５Ｍ。逡逑综合所检测试管的吸光度值，得太子参ＰＦ４０多糖的洗脱曲线，如图１－１所示。逡逑＇逦ｌ＼逦｜逦邋０．５逡逑２０－逦Ｉ逦ｉ逡逑１逦丨逦－０．４逡逑｜邋－邋Ｉ逦！逦１逡逑１０邋＿逦ｊ＼邋！逦１逦－邋０．２逡逑＿邋］丨邋Ａ邋，逡逑０逦５０逦１００逦１５０逦２００逦２５０逦３００逦３５０逦４００逦４５０逡逑管数逡逑图１－１太子参ＰＦ４０多糖Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ＤＥ－５２洗脱曲线逡逑太子参ＰＦ４０多糖以ＤＥＡＥ－５２为柱填料，用３种不同的流动相洗脱，得到了邋６种不逡逑同的组分，其重量分别为：Ｈ－１邋为邋１７５０ｍｇ，Ｈ－２邋为邋６７６．５６ｍｇ，Ｈ－３邋为邋３２４．４０ｍｇ，０．２Ｍ－１逡逑为邋２６８．００ｍｇ，０．２Ｍ－２邋为邋２４０．４．０ｍｇ，０．５Ｍ邋为邋１９８．４２ｍｇ。逡逑２．２＿２邋Ｓ－３００ＨＲ邋柱分离逡逑２．２．２．１填料预处理取７５０ｍＬ邋Ｓ－３００ＨＲ的柱填料，力口入３Ｌ超纯水，混匀，静置３０ｍｉｎ，逡逑期间每５ｍｉｎ摇匀一次，使其充分混匀。抽滤填料，再加入蒸馏水重复上述操作２次，逡逑以确保保存Ｓ－３００ＨＲ的乙醇除干净。抽滤填料，加蒸馏水浸泡备用。逡逑２．２．２．２填料装柱将蒸馏水浸泡的Ｓ－３００ＨＲ柱填料导入抽滤瓶中

溶液使标准品浓度为４ｍｇ／ｍＬ，过０．２２ｐｍ微孔滤膜。按“３．２．１项”下的色谱条件检测，逡逑以标准品的保留时间（＆）为横坐标，以标准品分子量的对数值为纵坐标（ＬｏｇＭ）。得逡逑线性回归方程ＬｏｇＭ二－０．１９００９＆＋１１．２７２３，相关系数尸０．９９３０，结果见图１－７。逡逑Ｉ逡逑４＿逡逑■逡逑３邋Ｊ逦１逦１逦逦逦［逦＇逦１逦＇逡逑３２逦３６逦４０逡逑图１－７标准品分子量标准曲线逡逑３．２．３样品分析准确称取太子参均一多糖Ｈ－ｌ－ｌ、Ｈ－２－ｌ、Ｈ－３－ｌ、０．２Ｍ－ｌ－ｌ、０．２Ｍ－２－ｌ、逡逑０．５Ｍ各ｌ．ＯＯｍｇ，加入０．１ｍｏｌ／ＬＮａＮＯ３溶液使样品多糖浓度为４ｍｇ／ｍＬ。过０．２２哗微孔逡逑滤膜，按“３．２．１项”下的色谱条件检测，结果见图１－８。逡逑１７逡逑

３．逦１邋Ｈ－１－２太子参均一多糖结构的分析逡逑３．１．１多糖的单糖组成测定通过ＰＭＰ衍生化及高效液相色谱联用对多糖的单糖组逡逑成进行测定，结果如图２－１所示。结果显示样品只出现了单一对称峰，通过与对照品的逡逑比较可以得出此峰为Ｄ－葡萄糖。表明了样品多糖是由Ｄ－葡萄糖组成的。逡逑□邋ＷＵ邋＊ｊｖｔｌｔｎｓｔｆｐ２５４邋ｎ邋？邋，ＴＪＵ２）１３0ｍａ２０１３－ｔ１－０１邋ｉＷ２－４Ｗｆｌ１３１０１ＳＯ）ＣＣ０Ｃ４邋Ｄ）逡逑２０００－逦Ｉ逡逑．逡逑１０００逡逑５００．逦ｌ逡逑0逦Ｊ逦Ｊ邋Ｖ邋，逦逦逦逡逑０逦Ｓ逦１０逦１５逦＇逦２０逦？逦３０逦逡逑图２－１逦Ｈ－１－２多糖的单糖组成分子逡逑３．１．２多糖比旋光度的测定Ｄ－葡萄糖分为ａ－异构体和Ｐ异构体，它们是一对非对映逡逑体。可以通过比旋光度来区分，虽然这对非对映体的比旋光度都为正值，但是ａ－异构体逡逑有相对较大的比旋光度。通过检测得出样品比旋光度为［ａ］２５邋Ｄ＝＋１６８．１°是较大的正值，逡逑说明了样品多糖可能是ａ－糖苷键构型的大分子多糖。逡逑３．１．３多糖的红外光谱分析红外光谱根据峰位、峰型及峰强来确定官能团的存在。逡逑通过样品多糖的红外光谱图２－２所示

【参考文献】

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本文编号：2788624