焦槟榔“长于消食导滞”的炮制机制及其槟榔碱适宜含量的研究

发布时间：2020-08-11 16:00

【摘要】：槟榔(Arecae Semen)是棕榈科(Palmae)植物槟榔Areca catechu L.的干燥成熟种子,传统功效为驱虫、消积、行气、利水和截疟。中医传统临床应用认为槟榔炒焦后“长于消食导滞”,然而目前缺乏系统的药效学证据,尚停留在传统应用共识的层面;此外,当前也缺乏槟榔炒焦“长于消食导滞”的炮制机制和相关物质基础的研究。近年来,研究报道发现槟榔碱有一定的毒性,然而目前对于槟榔药材饮片及其炮制品的质量控制往往只注重槟榔碱的最低含量而忽视其最高限量。目的:系统研究槟榔炒焦前后的成分变化(包括还原性单糖及低聚糖、氨基酸、美拉德产物和多糖),并结合“高效液相色谱(HPLC)-促胃肠动力活性”谱-效关系的研究,初步阐明槟榔炒焦“长于消食导滞”的炮制机制。以“目标成分去除”结合生物活性评价的思路,筛选槟榔碱在焦槟榔饮片中的适宜含量,为焦槟榔饮片的合理炮制工艺及质量控制提供科学依据。方法:1.采用“在线非接触红外测温系统”实时监测炒药机中药材的温度变化,以自动控温炒药机制备槟榔炒制样品,为后续的槟榔炒焦“长于消食导滞”炮制机制的研究提供实验样品。2.通过离体和整体动物模型,比较生槟榔和焦槟榔对大鼠胃肠平滑肌张力及小鼠胃肠运动的作用,并以阿托品所致的胃肠运动迟缓小鼠模型进一步评价,以验证槟榔炒焦“长于消食导滞”。3.以HPLC法比较槟榔炒焦前后化学成分变化,以制备HPLC(PHPLC)技术分离槟榔炒焦后新产生的化学成分,通过1H-NMR和13C-NMR技术鉴定新产生的成分;比较槟榔炒焦前后氨基酸和还原性单糖的变化,分析新产生成分可能的生成机制;以响应面法优化槟榔多糖的提取工艺,比较槟榔炒焦前后多糖含量的变化;基于HPLC指纹图谱和肠平滑肌张力,采用SPSS软件及双变量相关法分析16批槟榔炒制样品“HPLC谱-促胃肠动力”谱-效关系。4.以制备TLC色谱技术(PTLC)制备“槟榔碱完全去除的焦槟榔提取物(WAC-100R,R意思是去除槟榔碱)”;并通过焦槟榔提取物(WAC)和WAC-100R的组合制备“一系列的槟榔碱不同程度去除的焦槟榔提取物(WAC-Rx)”。5.采用急性毒性实验,评价WAC-Rx[WAC、WAC-30R(意思是“去除了30%槟榔碱的焦槟榔提取物”)、WAC-50R和WAC-100R]对小鼠的半数致死量(LD50);以MTT法考察WAC-Rx(WAC、WAC-10R、WAC-20R、WAC-30R、WAC-40R、WAC-50R、WAC-60R、WAC-70R、WAC-80R、WAC-90R和WAC-100R)对上皮细胞(Ha Ca T细胞)的细胞毒性;以离体和整体动物模型评价WAC-Rx(WAC、WAC-30R、WAC-50R和WAC-100R)对大鼠离体胃肠平滑肌张力及小鼠胃肠运动的影响,并通过阿托品所致的胃肠运动迟缓小鼠模型进一步确证。6.以流式细胞术和细胞DAPI染色实验比较WAC-Rx(WAC、WAC-30R、WAC-50R和WAC-100R)诱导Ha Ca T细胞凋亡的作用;以western blot法比较WAC-Rx(WAC、WAC-30R、WAC-50R和WAC-100R)对凋亡蛋白(Caspase-3)、原癌基因(c-fos和c-jun)和促炎症因子(COX-2、PGE2和IL-1α)在Ha Ca T细胞中表达的影响。结果:1.焦槟榔与生槟榔提取物均能显著提高大鼠离体胃肠平滑肌张力;和生槟榔相比,在浓度高于10μg/m L时,焦槟榔具有更强的增强胃肠平滑肌条张力的作用。在体动物实验表明,焦槟榔和生槟榔均能显著增强小鼠胃排空和肠推进,其中以焦槟榔为佳;硫酸阿托品造模的动物实验也表明焦槟榔和生槟榔均能改善模型小鼠胃肠运动,但焦槟榔作用更强。2.应用PHPLC技术,成功分离得到槟榔炒焦后新产生的3个成分,分别鉴定为:2,3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyranone(DDMP)、5-Hydroxymethyl-2-furfural(5-HMF)和3-hydroxy-2-methyl-γ-pyrone(Maltol)。槟榔炒焦后氨基酸含量显著降低(降低程度为:精氨酸赖氨酸脯氨酸丝氨酸)、还原性糖(包括:葡萄糖、果糖)含量也有明显的下降、p H值下降而A420值增高,表明槟榔在炒焦的炮制过程中发生了美拉德反应,新产生这3个的化合物为美拉德反应的中间产物。3.基于响应面法,本文优化了槟榔多糖的提取工艺,并比较了槟榔炒焦前后多糖的含量及其单糖组成和分子量分布等方面变化。结果表明:槟榔炒焦后水提液中多糖含量明显增高;多糖的单糖组成变化不明显但是比例有明显变化。4.实验测定了16批槟榔炒制样品(40μg/m L)对肠平滑肌张力的作用以及相应的HPLC指纹图谱。“谱效关系”研究表明:16批槟榔炒制样品共有14个特征峰,有5个共有特征峰与肠平滑肌张力均呈现正相关且具有统计学意义,特别是3个美拉德产物与十二指肠平滑肌张力密切相关且具有统计学意义:DDMP(相关系数:0.872,p0.01)、5-HMF(相关系数:0.843,p0.01)和Maltol(相关系数:0.782,p0.01)。5.采用三氯甲烷(CHCl3)萃取得到焦槟榔总生物碱(TAE),以PTLC去除TAE中槟榔碱,并成功制备WAC-100R以及WAC-Rx(WAC-10R、WAC-20R、WAC-30R、WAC-40R、WAC-50R、WAC-60R、WAC-70R、WAC-80R和WAC-90R)。6.WAC对于Ha Ca T细胞有一定的细胞毒性,其半数抑制浓度(IC50)为107.73μg/m L。去除50%的槟榔碱后(WAC-50R~WAC-100R),其细胞毒性显著降低(IC50400μg/m L)。另外,WAC灌胃对小鼠有一定的毒性,其LD50为15.302 g/kg;去除50%后的槟榔碱的WAC-Rx(WAC-50R和WAC-100R)未观察到明显的毒性。和WAC相比,槟榔碱去除不高于50%的WAC-Rx(WAC-30R和WAC-50R)对胃肠平滑肌张力和胃肠运动(胃排空和肠推进)的作用不会有明显的降低。7.与WAC组对比,WAC-50R和WAC-100R导致的Ha Ca T细胞凋亡显著减弱,且诱导的Caspase-3、c-jun、c-fos、COX-2、PGE2和IL-1α在Ha Ca T细胞中的表达也明显低于WAC组。8.实验结果表明去除原焦槟榔50%槟榔碱可进一步降低其副作用且能保证“消食导滞”的作用。本次采用的焦槟榔饮片中槟榔碱含量约0.239%,因此我们认为0.12%是焦槟榔中槟榔碱的适宜含量。结论:槟榔炒焦“长于消食导滞”的炮制机制与以下三方面相关:(1)槟榔碱在一定的剂量内表现出明显的促胃肠动力活性,炒焦除去了一部分槟榔碱而使其在焦槟榔中的含量更合理;(2)槟榔炒焦过程中发生了美拉德反应,其新产生的美拉德产物(如DDMP、5-HMF和Maltol等)与槟榔炒焦“消食导滞”作用增强密切相关;(3)多糖可能也是槟榔“消食导滞”的效应物质,炒焦可使槟榔多糖成分更利于溶出和提取。本研究提示焦槟榔中槟榔碱的适宜含量约为0.12%;“目标成分去除”结合活性评价的策略可用于研究毒性成分在中药饮片中的适宜含量,有利于制定合理的中药饮片炮制工艺规范及质量标准。创新点:1.本课题首次研究了槟榔炒制样品的“HPLC-促胃肠运动活性”谱效关系,发现槟榔炒制品促进胃肠运动的作用与炮制过程中产生的美拉德反应产物(如:DDMP、5-HMF和Maltol等)密切相关。2.本课题通过实验研究初步阐明了槟榔炒焦后“消食导滞”作用增强的炮制机制,为槟榔炒焦“长于消食导滞”提供了一定的科学依据。3.本次研究首次以“目标成分去除”结合活性评价的策略,研究了焦槟榔中槟榔碱的适宜含量。本次实验发现槟榔碱在焦槟榔中较适宜含量约为0.12%。本次研究为焦槟榔炮制工艺中槟榔碱的含量控制提供一定的科学依据,也为其他有毒成分在中药饮片中的含量限度研究提供新的思路,有利于制定合理的中药饮片炮制工艺规范及质量标准。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R283
【图文】：

槟榔,生理盐水,小鼠,肠推进

图 1-1. 生槟榔和焦槟榔对小鼠胃 (A)、肠 (B)离体平滑肌张力的影响.NS：生理盐水，AN：生槟榔，CAN：焦槟榔；**p < 0.01, *p < 0.05 vs. NS;##p < 0.01 vs. AN.Figure 1-1. Effects of areca nut (AN) and charred areca nut (CAN) on gastric (A) andintestinal (B) smooth muscle contraction in vitro.3.2 生槟榔和焦槟榔对小鼠胃排空和肠推进的作用如图 1-2 所示，焦槟榔样品（CAN，50，100 和 200 mg/kg）均能显著增加小鼠胃排空率和小肠推进率（p < 0.05，p < 0.01 和 p < 0.01）；生槟榔样品（AN，50，100 和 200mg/kg）也表现出明显的增加胃排空率和小肠推进率的作用（p < 0.05，p < 0.01，p < 0.01）。和生槟榔组相比，焦槟榔样品（100 和 200 mg/kg）则表现出更强的促进胃排空和肠推进的作用（p < 0.05）。

槟榔,肠推进,胃肠运动,胃肠功能

图 1-2. 生槟榔和焦槟榔对小鼠胃排空（A）和肠推进（B）的影响.AN：生槟榔，CAN：焦槟榔；**p < 0.01, *p < 0.05 vs. control;#p < 0.05 vs. AN.Figure 1-2. Effects of areca nut (AN) and charred areca nut (CAN) on gastric emptying (A)and intestinal transit (B) of normal mice.3.3 生槟榔和焦槟榔对阿托品所致胃肠功能迟缓小鼠模型胃肠运动的影响根据 3.2 的结果，我们选择 200 mg/kg 的槟榔提取物进行进一步的实验。如图 1-3所示，硫酸阿托品腹腔注射造模后，小鼠胃肠运动明显减弱（p < 0.01）。给予样品后（200mg/kg），生槟榔组（AN）和焦槟榔组（CAN）小鼠胃肠运动显著增强（p < 0.05）。实验结果也显示，和生槟榔组相比，焦槟榔样品对硫酸阿托品所致的小鼠胃肠功能迟缓具有更强的改善作用（p < 0.05）。

槟榔,胃肠功能,肠推进,模型小鼠

图 1-3. 生槟榔和焦槟榔对硫酸阿托品所致胃肠功能迟缓模型小鼠胃排空（A）和肠推进（B）的影响.AN：生槟榔，CAN：焦槟榔；**p < 0.01, *p < 0.05 vs. Control; #p < 0.05 vs. AN.Figure 1-3. Effects of areca nut (AN) and charred areca nut (CAN) on gastric emptying (A)and intestinal transit (B) of atropine sulphate treated mice.4 结论本节实验通过离体和在体动物模型系统比较了生槟榔和焦槟榔对进胃肠运动的作用。本次研究表明，生槟榔和焦槟榔提取物均能明显的促进胃肠运动，而且以焦槟榔为佳。本次实验采用阿托品所致的小鼠胃肠运动迟缓模型[23]进一步验证槟榔的“长于消食导滞”的特性，研究结果同样表明生槟榔和焦槟榔都能显著改善模型小鼠胃肠运动，并且焦槟榔比生槟榔更有优势。

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