超促排卵小鼠模型观察及补肾活血方改善其早期妊娠丢失的机制研究

发布时间：2020-08-12 02:38

【摘要】：第一部分超促排卵小鼠模型的建立以及超促排卵对小鼠子代青春期与动情周期的影响目的:建立超促排卵(COH)小鼠模型,并利用该模型研究超促排卵对小鼠子代青春期与动情周期的影响。方法:将40只雌性昆明小鼠随机分为两组,COH组采用7.5 IU孕马血清促性腺激素(PMSG)和7.5 IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)对动情周期稳定的雌性小鼠进行超促排卵,以获得第一代的雌性子代小鼠。正常组在相同的时间点给予等量的生理盐水腹腔注射作为对照,于动情期与雄鼠合笼以获取子代小鼠。待雌性子代小鼠断奶后,筛选体质指数(BMI)相近的各组小鼠观察其阴门开放和第一次动情周期出现的时间,并检测28日龄雌性子代小鼠血清中E_2,AMH,FSH和LH的水平,以及卵巢中Esr1,Amhr2,Fshr和Lhcgr的mRNA表达,并且进行卵泡计数和卵巢组织形态学的观察。我们还通过TUNEL方法研究了卵泡颗粒细胞的凋亡,运用Real-time qPCR检测卵巢中Fas,FasL,Bax,Bcl2和Caspase 3,8,9的mRNA表达;并采用Western blot检测Cleaved-caspase 3,8,9的蛋白质表达。此外,我们进一步观察了雌性子代成年小鼠动情周期的规律性,进行卵泡计数并测量血清和卵巢中的AMH的水平。结果:与自然妊娠相比较,COH导致小鼠不良的妊娠结局,表现为妊娠期时间延长,并伴有大量死胎,妊娠丢失率升高。与正常组的雌性子代小鼠进行对比,COH组的雌性子代小鼠第一次动情周期出现的时间延迟,卵泡计数显示其具有更多的闭锁卵泡,并伴有更明显的卵泡颗粒细胞的凋亡,卵巢中颗粒细胞相关凋亡因子如:FasL,Bax,Caspase3,8,9的mRNA水平显著增加,Cleaved-caspase 8的蛋白质水平显著上升。同时我们发现,28日龄的COH组雌性子代小鼠的血清LH和E_2水平显著低于正常组雌性子代小鼠,并且其卵巢中相应激素受体Amhr2,Fshr,Lhcgr和Esr1的mRNA水平全部显著下调。此外,我们持续观察了两组雌性子代小鼠成年之后(56日龄)的动情周期规律性,尽管动情周期的平均天数相差无几,与正常组相比,COH组雌性子代小鼠的动情期相对延长,而动情前期相对缩短。卵泡计数显示COH组56日龄的雌性子代小鼠的始基卵泡和初级卵泡的数目显著减少,而其血清和卵巢中的AMH水平显著升高。结论:COH可导致母体不良的妊娠结局,并对小鼠雌性子代的卵泡发育产生不利影响,导致雌性子代小鼠的青春期转化延迟以及随后成年期的动情周期紊乱。其机制可能与激素分泌失调,卵泡颗粒细胞凋亡增加,卵巢相关激素受体的表达下调有关。第二部分补肾活血方改善超促排卵小鼠模型早期妊娠丢失的疗效评估及其机制研究目的:观察补肾活血方改善超促排卵小鼠模型早期妊娠丢失的疗效并探索其潜在的作用机制。方法:将200只雌性昆明小鼠随机分为四组:对照组(Control)、模型组(Model)、补肾活血方正常剂量组(BSHXR1)和补肾活血方低剂量组(BSHXR2)。模型组和中药组的雌性小鼠采用7.5IU孕马血清促性腺激素(PMSG)和7.5IU人绒毛膜促性腺激素(HCG)进行超促排卵(COH)后与雄鼠以1:1的比例合笼。正常对照组在相同的时间点给予等量的生理盐水腹腔注射作为对照并于动情期与雄鼠以1:1的比例合笼。各组合笼小鼠于次日早晨8点检查阴栓,见栓日认为是妊娠的第1天。从妊娠的第一天(D1)开始,对照组和模型组的见栓小鼠每天给予0.3ml生理盐水灌胃,而BSHXR1和BSHXR2组,分别给予0.3ml的正常剂量和低剂量的补肾活血溶液灌胃。一部分孕鼠于妊娠D5、D6和D8处死以获取血清、卵巢和子宫标本,一部分孕鼠单笼饲养以观测其妊娠结局。利用放射免疫的方法测定血清中雌、孕激素的含量,并通过免疫组化染色观察各组卵巢和子宫的形态,蜕膜血管的形成,子宫中激素受体ERα,PR以及血管生成因子VEGFA,ANGPT2和FGF2的表达,并利用Real-time q PCR和Western blot的方法分别检测子宫中相关因子的m RNA和蛋白质的表达水平。结果:与对照组相比较,COH小鼠着床后的胚胎丢失率显著增加,并出现了大量死胎,伴有妊娠期的显著延长,而补肾活血方能够减少胚胎丢失,维持孕早期胚胎的存活。COH过度刺激卵巢使其体积与重量均显著增加,血清中雌、孕激素的含量大幅上升,子宫蜕膜化受损,子宫中相关激素受体ERα,PR的表达下调,然而补肾活血方能够通过改善卵巢的过度刺激状态,控制雌、孕激素的过度分泌,上调子宫上皮和基质中激素受体ERα,PR的表达,促进妊娠的顺利进行。此外,补肾活血方能够通过上调子宫蜕膜血管窦FGF2的表达,增加蜕膜血管的密度并有利于血管的发育与成熟,进而为胚胎提供足够的血液供应及支持后续胎盘的形成。结论:COH可导致卵巢过度刺激的状态,引起雌、孕激素及其子宫中相应受体的协调运作发生紊乱,同时损害了蜕膜血管的发育与成熟,导致母体不良的妊娠结局,而补肾活血方能够有效降低着床后的胚胎丢失率,促进妊娠的建立与维持,其机制可能与降低过度分泌的雌、孕激素,增强上皮和基质中激素受体ERα,PR的表达,上调子宫蜕膜血管窦FGF2的表达水平有关。由此可见,我们的研究为补肾活血方治疗早期妊娠丢失的临床应用提供了科学的证据,同时为进一步的基础研究奠定了基础。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-332;R285.5
【图文】：

实验设计,日龄

图 1 实验设计概述。妊娠第五天记录小鼠的着床位点。筛选 1 日龄，21 日龄，28 日龄和 56 日龄的子代雌性小鼠用于各项指标的观测与分析，并提供各项指标的每组样本数目。

动情周期,阴门

代小鼠出现第一次动情周期的时间显著晚于正常雌性子代小鼠(P<0.05)（见图2B）。并且，COH组的雌性子代小鼠第一次阴门开与第一次动情周期出现之间的时间差显著长于正常雌性子代小鼠(P<0.01)（见图2C）。图2 COH组的雌性子代小鼠显示出第一次动情周期延迟。（A）比较两组雌性子代小鼠第一次阴门开的时间，n=18。（B）比较两组雌性子代小鼠第一次动情周期出现的时间，n=9 11。（C）比较两组第一次阴门开与第一次动情周期出现之间的时间差，n=9 11。与正常组相比：*P < 0.05，**P < 0.01。为了进一步探索COH雌性子代小鼠第一次动情周期延迟的原因，我们分析了出现动情周期之前的D28日龄子代小鼠的卵泡生长情况。结果显示COH组的雌性子代小鼠的闭2.COH对雌性子代青春期转化的影响

闭锁卵泡,日龄,卵泡,代表性

图3 28日龄的COH雌性子代小鼠显示出更多的闭锁卵泡。（A）比较两组间各阶段卵泡的百分比。n=6, 与正常组相比，*P <0.05。PDF,始基卵泡; PMF,初级卵泡; SEF,次级卵泡; TEF,窦状卵泡; ATF,闭锁卵泡; TF,总卵泡。（B）正常组雌性子代小鼠卵巢的代表性图片，bar = 200 μm.（C）COH组雌性子代小鼠卵巢的代表性图片，bar = 200 μm。

【参考文献】