丹参酮Ⅰ通过调节Nrf2-ARE信号通路在肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用研究

发布时间：2020-08-12 08:49

【摘要】：目的:探讨丹参酮Ⅰ在肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用及相关机制。方法:细胞实验:1、利用不同浓度的丹参酮Ⅰ(TanshinoneⅠ,T-Ⅰ)处理人肾小管上皮细胞(HK-2),利用CCK-8试剂盒检测各组细胞活力,检测T-Ⅰ药物毒性;2、利用不同浓度的H2O2处理HK-2,2h后检测各组细胞活力,选取构建氧化应激模型最佳H2O2浓度;3、丹参酮Ⅰ药效实验:设置4个实验组,对照组1(control)、对照组2(T-Ⅰ)、模型组1(H2O2)、模型组2(H2O2+T-Ⅰ),利用丹参酮Ⅰ或其溶剂处理24h,然后H2O2组及H2O2+T-Ⅰ组利用过氧化氢处理2h,CCK-8检测各组细胞活力、流式细胞术Annexin V-FITC/PⅠ双染法定量检测各组细胞凋亡情况;4、通过DCFH-DA法对各组细胞内的活性氧水平在荧光显微镜下观察;5、利用RT-qPCR及Western Blot检测各组细胞中Nrf2及其下游基因表达情况;6、Nrf2敲降之后利用RT-qPCR检测细胞内Nrf2及其下游基因的表达,之后使用Nrf2-的HK-2重复丹参酮Ⅰ药效实验,检测各组细胞活力。动物实验:1、32只8周雄性ICR小鼠枿机分为4组:假手术组1(sham),假手术组2(sham+T-Ⅰ),手术组1(ⅠR),手术组2(IR+T-Ⅰ),每组8只,sham+T-Ⅰ组及IR+T-Ⅰ组予以丹参酮Ⅰ腹腔注射两周,sham组及IR组腹腔注射等量溶剂;2、建立肾脏缺血再灌注模型:手术组予以游离并夹闭左肾血管50min,切除右肾;假手术组仅切除右肾,游离左肾血管,不阻断血供;术后48h留取各组小鼠左肾组织及血清标本;3、检测血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平,评估肾脏功能;4、肾脏组织切片HE染色观察组织形态学的改变,并进行组织病理学评分;5、检测各组小鼠肾脏中SOD活力及MDA含量,评估氧化应激状态;6、通过免疫组化观察肾脏组织中CD8、IL-6的表达,评估各组小鼠肾脏的炎症状态;7、Tunel法检测各组小鼠肾脏组织细胞凋亡情况;8、利用RT-qPCR及Western Blot检测各组小鼠肾脏中Nrf2及其下游基因表达情况。结果:细胞实验:细胞毒性实验显示3.5μM及更低浓度的T-Ⅰ对HK-2没有细胞毒性,过氧化氢毒性试验显示2mM为氧化应激模型最佳处理浓度;T-Ⅰ药效实验:T-Ⅰ可显著减轻H2O2导致的HK-2细胞活力下降并且可以减少H2O2导致的细胞凋亡;DCFA-DA活性氧检测结果显示T-Ⅰ可显著减少H2O2诱导后的细胞内活性氧水平;信号通路研究发现T-Ⅰ可上调Nrf2下游相关基因的mRNA以及蛋白水平,且能够上调Nrf2在胞质以及胞核的蛋白水平;且Nrf2敲降之后丹参酮Ⅰ不能改善H2O2导致的细胞活力下降。动物实验:T-Ⅰ可降低IR导致的小鼠血清肌酐、尿素氮升高,改善IR引起的肾脏组织病理学改变,且T-Ⅰ治疗组小鼠肾脏炎症状态减轻、细胞凋亡减少;T-Ⅰ预处理可增加IR后肾脏组织内SOD活力、降低MDA含量;信号通路研究发现T-Ⅰ可增加小鼠肾脏内Nrf2表达及上调核内Nrf2蛋白水平,并且可明显上调小鼠肾脏组织中Nrf2下游基因GCLC、HMOX1、GPX2的mRNA及蛋白水平。结论:丹参酮Ⅰ可以激活Nrf2-ARE信号通路发挥抗氧化作用,进而在肾脏缺血再灌注损伤中起到保护作用,为肾脏缺血再灌注损伤提供新的治疗策略。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

药物毒性,丹参酮

实验结果逡逑１．逦Ｔ－Ｉ对ＨＫ－２药物毒性研宄逡逑如图１．１所示：利用丹参酮Ｉ处理细胞２４ｈ及４８ｈ之后，３．５＾Ｍ以及更逡逑低浓度的丹参酮Ｉ未见明显毒副作用，（Ｐ＞0．0５），而经过４ｐＭ以及更高浓度逡逑的丹参酮Ｉ预处理２４ｈ和４８ｈ之后，ＨＫ－２细胞活力较对照组明显下降逡逑（Ｐ＜０．０５）；后续实验选用丹参酮Ｉ浓度为３ｐＭ。逡逑２４ｈ逦４８ｈ逡逑１．５－１逦１．５－逡逑＾ｌｌＢｉｓｉｉ！。棚ｉｌｉｉ逡逑0０＜＂逦00？逡逑Ｔ－Ｉ邋（ｊｉＷ）逦Ｔ－ｌ邋（ｙＭ）逡逑图１．１邋Ｔ－Ｉ对ＨＫ－２药物毒性研宄（＊，与ｃｏｎｔｒｏｌ组相比Ｐ＜０．０５）逡逑２．

细胞活力,过氧化氢浓度,丹参酮,变化关系

细胞活力,细胞凋亡,凋亡

逑３．逦Ｔ－Ｉ减轻Ｈ２0２模拟的氧化应激模型导致的ＨＫ－２细胞活力下降逡逑各组ＨＫ－２细胞活力结果如图１．３所示，模型组（Ｈ２0２组及Ｈ２０２＋Ｔ－Ｉ组）细胞逡逑活力较对照组（ｃｏｎｔｒｏｌ组及Ｔ－Ｉ组）显著下降，而Ｈ２０２＋Ｔ－Ｉ组细胞活力较逡逑Ｈ２Ｏ２组明显升高（Ｐ＜0．0５）。逡逑１．２－．逡逑１．０－邋｜－Ｉ－｜逦＊逡逑Ｉ０－８－逦＿逦—ｉ逡逑０６＇逦■逦ｔ邋■逡逑”：Ｉ＂逡逑■逡逑0－0Ｍ邋Ｉ邋Ｌ－ｒ逡逑图１．３邋Ｔ－Ｉ减轻Ｈ２０２导致的细胞活力下降（＊，邋Ｐ＜０．０５）逡逑４．逦Ｔ－丨减轻Ｈ２0２导致的ＨＫ－２细胞凋亡逡逑利用Ａｎｎｅｘｉｎ邋Ｖ－ＦＩＴＣ／ＰＩ双染法检测各组细胞的凋亡情况，结果如图１．４逡逑所示，Ｑ４、Ｑ２分别代表早期及晚期凋亡（图Ａ），定量结果显示Ｈ２０２组细逡逑胞凋亡比例较ｃｏｎｔｒｏｌ组及Ｔ－Ｉ组显著增加，而Ｈ２０２＋Ｔ－Ｉ组细胞凋亡比例较逡逑Ｈ２Ｏ２组有所下降（Ｐ＜0．0５）。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ｃｏｎｔｒｏｌ逦逦邋Ｔ－藤邋｜逦逦逡逑２５－１逡逑々邋。，＊逡逑￡２。－逦＿逡逑｜邋ｉｓ－逦■逡逑ｍＣ＇Ａ逦Ｍ逡逑Ｈ，0，逦￣￣Ｉ邋｜Ｈ

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